1、NORME INTERNATIONALE ISO 3496 Deuxime dition 1994-09-01 Viandes et produits base de viande - Dtermination de la teneur en hydroxyproline Meat and meat products - De termina tien of hydroxyproline content Numro de rfrence ISO 34969 994(F) ISO 3496: 1994(F) Avant-propos LISO (Organisation internationa
2、le de normalisation) est une fdration mondiale dorganismes nationaux de normalisation (comits membres de IISO). Lelaboration des Normes internationales est en gnral confiee aux comites techniques de IISO. Chaque comit membre interesse par une tude a le droit de faire partie du comite technique cree
3、a cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non gouvernemen- tales, en liaison avec IISO participent galement aux travaux. LISO colla- bore troitement avec la Commission lectrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation lectrotechnique. Les projets de N
4、ormes internationales adoptes par les comits techniques sont soumis aux comites membres pour vote. Leur publication comme Normes internationales requiert lapprobation de 75 % au moins des co- mites membres votants. La Norme internationale ISO 3496 a t labore par le comit technique ISO/K 34, Produits
5、 agricoles alimentaires, sous-comit SC 6, Viande et produits base de viande. Cette deuxime dition annule et remplace la premire dition (ISO 3496:1978), qui a fait lobjet dune revision technique. Lannexe A de la prsente Norme internationale est donne uniquement a titre dinformation. a3 ISO 1994 Droit
6、s de reproduction rservs. Sauf prescription diffrente, aucune partie de cette publi- cation ne peut tre reproduite ni utilise sous quelque forme que ce soit et par aucun pro- cd, lectronique ou mcanique, y compris la photocopie et les microfilms, sans laccord crit de lditeur. Organisation internatio
7、nale de normalisation Case Postale 56 l CH-l 211 Geneve 20 l Suisse Imprim en Suisse ii NORME INTERNATIONALE 0 ISO ISO 3496: 1994(F) Viandes et produits base de viande - Dtermination de la teneur en hydroxyproline 1 Domaine dapplication La prsente Norme internationale prescrit une m- thode pour la d
8、etermination de la teneur en hydroxy- proline de toutes sortes de viandes et produits a base de viande, y compris la volaille. La mthode est applicable aux viandes et produits a base de viande ne contenant pas plus de 0,5 % (m/m) dhydroxyproline. 2 Dfinition Pour les besoins de la prsente Norme inte
9、rnationale, la dfinition suivante sapplique. 2.1 teneur en hydroxyproline des viandes et produits base de viande: Teneur en hydroxyproline dtermine selon le mode opratoire dcrit dans la prsente Norme internationale. Elle est exprime en pourcentage en masse. 3 Principe Hydrolyse dune prise dessai par
10、 lacide sulfurique a 105 “C. Filtration, puis dilution de Ihydrolysat. Oxyda- tion de Ihydroxyproline par la chloramine T, puis for- mation dun compose de couleur rouge avec le pdimthylaminobenzaldhyde. Mesurage photom- trique a la longueur donde de 558 nm. 4 Ractifs Utiliser uniquement des reactifs
11、 de qualit analytique reconnue et de leau distillee ou dmineralise ou de leau de puret au moins quivalente. 4.1 Acide sulfurique, solution c(H,SO,) x 3 mol/l. Ajouter 750 ml deau dans une fiole jauge de 2 1. Ajouter lentement, en agitant, 320 ml dacide sulfuri- que concentre (2 = 1,84 g/ml). Refroid
12、ir a tempra- ture ambiante et complter au trait repre avec de leau. 4.2 Solution tampon, pH = 6,8, compose de 260 g dacide citrique monohydrat (C,H,O,H,O); 14,0 g dhydroxyde de sodium; 7810 g dacetate de NaKH,CO,). sodium anhydre Dissoudre les ractifs dans 500 ml deau, et les transfrer quantitativem
13、ent dans une fiole jauge de 1 1. Ajouter 250 ml de propanol-1 et ajuster au trait avec de leau. Cette solution reste stable durant plusieurs semaines, si elle est conserve a 4 “C a labri de la lumiere. 4.3 Ractif la chloramine T Dissoudre 1,41 g de A/-chlore-p-tolune sulfonamide, sel de sodium trihy
14、drat (chloramine T) dans 100 ml de la solution tampon (4.2). Cette solution doit tre prpare immdiatement avant utilisation. 4.4 Ractif calorimtrique Dissoudre 10,O g de pdimthylaminobenzaldhyde dans 35 ml dune solution dacide perchlorique 60 % (m/m), puis verser lentement 65 ml de propanol-2. 1 60 3
15、496: 1994(F) 63 ISO Cette solution doit tre prpare le jour de son utili- sation. Sil est ncessaire de purifier le pdimthylamino- benzaldhyde (voir note 3 en 8.4), oprer comme suit. Prparer, a chaud, une solution saturee de pdimthylaminobenzaldhyde dans de Ithanol a 70 % (WV). Refroidir dabord a la t
16、emprature am- biante et enfin dans un rfrigrateur. Aprs environ 12 h, filtrer sur un entonnoir de Buchner. Laver avec un peu dthanol a 70 % (VYV). Dissoudre de nouveau chaud, dans de Ithanol 70 % (WV). Ajouter de leau glace et agiter soigneusement. Poursuivre ces oprations jusqu lobtention dune quan
17、tit suffi- sante de cristaux blanc laiteux. Laisser une nuit au rfrigrateur. Filtrer sur lentonnoir de Buchner, laver avec de Ithanol 50 % (WV), puis scher sous pression rduite en prsence doxyde de phosphore(V). 5.6 Feuilles daluminium ou de plastique opaques. 5.7 Bain deau, rglable a 60 “C + 0,5 “C
18、. 5.8 Spectromtre, permettant des mesurages a une longueur donde de 558 nm + 2 nm, ou colori- mtre photolectrique, quip dun filtre interferentiel avec absorption maximale 558 nm + 2 nm. - 5.9 Cuves en verre, de 10 mm de parcours optique. 5.10 Balance analytique, prcise a + 0,001 g prs. 5.11 Fioles j
19、auges, de 250 ml de capacit. 5.12 Verres de montre, de 5 cm a 6 cm de diam- tre. 4.5 Hydroxyproline, solutions talons, Dans une fiole jauge de 100 ml, prparer une solu- tion mre en dissolvant 50 mg dacide hydroxypyrrolidine-a-carbonique (hydroxyproline) dans de leau. Ajouter 1 goutte de la solution
20、dacide sul- furique (4.1) et complter au trait repre avec de leau. Cette solution reste stable durant au moins 1 mois 4 “C. Le jour de lemploi, introduire dans une fiole jauge de 500 ml, 5 ml de la solution mre et complt f r au trait repre avec de leau. Prparer ensuite quatre so- lutions talons en p
21、rlevant 10 ml, 20 ml, 30 ml et 40 ml de cette solution et en compltant 100 ml avec de leau, afin dobtenir respectivement des concentrations en hydroxyproline de 0,5 pg/ml, 1 pg/ml, 1,5 pg/ml et 2 pg/ml. 5 Appareillage 6 chantillonnage II est important que le laboratoire reoive un echan- tillon relle
22、ment reprsentatif, non endommag ou modifi lors du transport et de lentreposage. Lchantillonnage ne fait pas partie de la mthode spcifie dans la prsente Norme internationale. Une mthode dchantillonnage recommande est donne dans IISO 3100-I. Oprer sur un chantillon reprsentatif dau moins 200 g. Conser
23、ver lchantillon de faon viter toute dt- rioration et tout changement dans sa composition. 7 Prparation de lchantillon pour essai 7.1 Viandes crues et produits base de Matriel courant de laboratoire, et en particulier ce qui suit. viande crue Au moyen dun couteau bien aiguis, dcouper la 5.1 Hachoir l
24、ectrique viande, lames horizon- tales rotation rapide. . . viande en petits cubes (denviron 0,5 cm3 de volume, cest-dire denviron 8 mm de ct) alors quelle est encore froide (trs lgrement en dessous de 0 OC). 5.2 Ballon hydrolyse, fond rond ou fond plat, col large, denviron 200 ml de capacit. 5.3 tuv
25、e de schage, rglable 105 “C + 1 “C. - Placer lchantillon dans un rcipient que lon bou- chera hermtiquement, ou bien lemballer sous pres- sion rduite dans un sac en plastique thermorsistant. Chauffer ensuite le rcipient et lchantillon de ma- nire maintenir une temprature minimale de 70 “C 5.4 Disques
26、 de papier filtre, de l2,5 cm de diam- pendant au moins 30 min. Laisser refroidir et oprer tre. comme en 7.2. 5.5 pH-metre. Au cours des tapes suivantes de la prparation de lchantillon pour essai et de la pese de la prise 2 0 ISO ISO 3496: 1994(F) dessai, sassurer que lchantillon reste bien m- lang,
27、 et, en particulier, que la graisse et les portions fluides soient rgulirement rparties. NOTE 1 Ce traitement par la chaleur permet dattendrir le tissu conjonctif cru et de le rendre moins rsistant a lopration dhomognisation au moyen du hachoir. Ce- pendant, ce traitement peut galement provoquer la
28、spa- ration dun liquide contenant de la glatine. La prsence de graisse peut demander galement une attention particulire lors de la prparation dun chantillon homogne. 7.2 Viandes cuites et produits base de viande cuite Homogniser lchantillon dans le hachoir viande (5.1). Garder lchantillon homognis d
29、ans un flacon ferm, tanche et rempli compltement, et le conserver de faon viter toute dtrioration et tout changement dans sa composition. Analyser Ichan- tillon ds que possible, mais toujours dans les 24 h. 8 Mode opratoire 8.1 Prise dessai Peser 0,001 g prs, dans le ballon hydrolyse (5.2), environ
30、4 g de Iechantillon pour essai. Sassurer quil ne reste pas rale du ballon. de produit adhrant la paroi lat- 8.2 Hydrolyse 8.2.1 Ajouter 30 ml + 1 ml de solution dacide sul- - furique (4.1) dans le ballon. Le recouvrir avec un verre de montre (5.12) et placer lensemble dans ltuve (5.3) pendant 16 h (
31、une nuit) 105 “C. 8.2.2 Filtrer Ihydrolysat encore chaud sur un disque de papier filtre (5.4), en recueillant le filtrat dans une fiole jauge de 250 ml (5.11). Laver le papier filtre et le ballon trois fois avec des fractions de 10 ml de la solution dacide sulfurique (4.1) chaude, et ajouter les liq
32、uides de lavage Ihydrolysat. Complter au trait repre avec de leau et mlanger. 8.3 Dveloppement de la coloration et mesurage de Iabsorbance 8.3.1 laide dune pipette, introduire, dans une fiole jauge de 250 ml (5.1 l), un volume V de Ihydrolysat (8.2.2) permettant dobtenir, aprs dilution 250 ml, une c
33、oncentration en hydroxyproline com- prise entre 0,5 pg/ml et 2 pg/ml. Ajuster au trait re- pre avec de leau. NOTE 2 Dans la plupart des cas, V sera de lordre de 5 ml 25 ml, selon la quantit de tissu conjonctif prsente dans lchantillon. 8.3.2 Introduire 4,00 ml de cette solution (8.3.1) dans un tube
34、essais, puis ajouter 2,00 ml du ractif la chloramine T (4.3). Mlanger et laisser la tem- prature ambiante durant 20 min + 1 min. 8.3.3 Ajouter 2,00 ml du ractif calorimtrique (4.4), mlanger soigneusement et coiffer le tube avec une feuille daluminium ou de plastique (5.6). 8.3.4 Porter rapidement le
35、 tube dans le bain deau (5.7) rgl 60 OC, et chauffer pendant 20 min exac- tement. 8.3.5 Refroidir le tube pendant au moins 3 min leau courante, et le laisser la temprature ambiante pendant 30 min. 8.3.6 Mesurer Iabsorbance 558 nm + 2 nm par rapport leau dans une cuve en verre (5.9), au moyen du spec
36、tromtre ou du colorimtre photolectrique quip dun filtre interfrentiel (5.8). 8.3.7 Soustraire Iabsorbance mesuree partir de lessai blanc (8.4) et lire la concentration en hy- droxyproline de Ihydrolysat dilu sur la courbe dta- lonnage obtenue comme decrit en 8.5. 8.4 Essai blanc Effectuer, en double
37、, les oprations dcrites de 8.3.2 8.3.7 inclus, mais en remplaant Ihydrolysat dilu par de leau. NOTE 3 Si Iabsorbance de lessai blanc dpasse 0,040, prparer un nouveau ractif calorimtrique (4.4) et, si n- cessaire, purifier le pdimthylaminobenzaldehyde (voir 4.4). 8.5 Courbe dtalonnage 8.5.1 Reprendre
38、 le mode opratoire dcrit de 8.3.2 8.3.7 inclus, mais avec 4,00 ml de chacune des quatre solutions talons dilues dhydroxyproline (4.5) au lieu de Ihydrolysat dilu. 8.5.2 Porter sur un graphique les valeurs des absor- bances mesures et corriges pour lessai blanc, en fonction des concentrations corresp
39、ondantes des so- lutions talons dhydroxyproline. Runir les points et lorigine en traant une courbe aussi droite que pos- si ble. 3 ISO 3496: 1994(F) Q ISO tablir une nouvelle courbe dtalonnage pour chaque srie danalyse. 9 Calcul Pour chaque prise dessai, calculer la teneur en hy- droxyproline, en po
40、urcentage en masse, laide de la formule wh 6,25c =- mxV o wh est la teneur en hydroxyproline, exprime en pourcentage en masse, obtenue partir de la formule; C est la concentration en hydroxyproline, en microgrammes par millilitre, de Ihydrolysat dilu, lue sur la courbe dtalonnage; m est la masse, en
41、 grammes, de la prise dessai (8.1); V est le volume, en millilitres, de la partie aliquote de Ihydrolysat prleve pour la dilution 250 ml (voir 8.3.1). Exprimer le rsultat 0,Ol % prs. 10 Fidlit La fidlit de cette mthode a t tablie par un essai interlaboratoires ralis selon IISO 5725. Le niveau de pro
42、babilit de 95 % a t retenu po 4 r obtenir les valeurs de rptabilit et de reproductibi- . , Itte . 10.1 Rptabilit La difference absolue entre deux rsultats dessai in- dpendants, obtenus laide de la mme mthode sur un matriau identique soumis lessai dans le mme laboratoire et par le mme oprateur utilis
43、ant le mme appareillage et dans un court intervalle de temps, ne doit pas tre suprieure la valeur de Y donne par la formule r = 0,013 1 + 0,032 2 ijh o wh est la moyenne des deux rsultats dessai, pour la teneur en hydroxyproline, exprime en pourcentage en masse. Rejeter les deux rsultats si la diffr
44、ence dpasse la valeur indique ci-dessus, et raliser deux nouvelles dterminations 10.2 Reproductibilit La diffrence absolue entre deux resultats dessai in- dividuels, obtenus laide de la mme mthode sur un matriau identique soumis lessai dans des la- boratoires diffrents par des oprateurs diffrents ut
45、ilisant des appareillages diffrents, ne doit pas tre suprieure la valeur de R donne par la formule R = 0,019 5 + 0,052 9 i$ o Eh est la moyenne des deux rsultats dessai, pour la teneur en hydroxyproline, exprime en pourcentage en masse. 11 Rapport dessai Le rapport dessai doit indiquer la mthode sel
46、on laquelle lchantillonnage a te effectu, si elle est connue, la mthode utilise, le rsultat dessai obtenu, et si la rptabilit a t vrifie, le rsultat final cite qui a t obtenu. II doit, en outre, mentionner tous les dtails opratoi- res non prvus dans la prsente Norme internationale, ou facultatifs, a
47、insi que les incidents ventuels sus- ceptibles davoir agi sur le rsultat dessai. Le rapport dessai doit donner tous les rensei- gnements ncessaires lidentification complte de lchantillon. ISO 3496: 1994(F) Annexe A (informative) Bibliographie 1 ISO 3100-I :1991, Viandes et produits base de 2 ISO 5725:1986, Fidlit des mthodes dessai viande - chantillonnage et prparation des - Ddtermination de la rptabilit et de la re- khantillons pour essai - Partie 1: chantillon- productibilit du
