1、 ISO 2013 Produits alimentaires Mthodes danalyse pour la dtection des organismes gntiquement modifis et des produits drivs Extraction des acides nucliques AMENDEMENT 1 Foodstuffs Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived products Nucleic acid extraction AMEN
2、DMENT 1 NORME INTERNATIONALE ISO 21571 Premire dition 2005-02-15 Numro de rfrence ISO 21571:2005/Amd.1:2013(F) AMENDEMENT 1 2013-03-15 ISO 21571:2005/Amd.1:2013(F)ii ISO 2013 Tous droits rservs DOCUMENT PROTG PAR COPYRIGHT ISO 2013 Droits de reproduction rservs. Sauf indication contraire, aucune par
3、tie de cette publication ne peut tre reproduite ni utilise sous quelque forme que ce soit et par aucun procd, lectronique ou mcanique, y compris la photocopie, laffichage sur linternet ou sur un Intranet, sans autorisation crite pralable. Les demandes dautorisation peuvent tre adresses lISO ladresse
4、 ci-aprs ou au comit membre de lISO dans le pays du demandeur. ISO copyright office Case postale 56 CH-1211 Geneva 20 Tel. + 41 22 749 01 11 Fax + 41 22 749 09 47 E-mail copyrightiso.org Web www.iso.org Publi en Suisse ISO 21571:2005/Amd.1:2013(F) Avant-propos LISO (Organisation internationale de no
5、rmalisation) est une fdration mondiale dorganismes nationaux de normalisation (comits membres de lISO). Llaboration des Normes internationales est en gnral confie aux comits techniques de lISO. Chaque comit membre intress par une tude a le droit de faire partie du comit technique cr cet effet. Les o
6、rganisations internationales, gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec lISO participent galement aux travaux. L ISO collabore troitement avec la Commission lectrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation lectrotechnique. Les Normes internationales sont rdige
7、s conformment aux rgles donnes dans les Directives ISO/CEI, Partie 2. La tche principale des comits techniques est dlaborer les Normes internationales. Les projets de Normes internationales adopts par les comits techniques sont soumis aux comits membres pour vote. Leur publication comme Normes inter
8、nationales requiert lapprobation de 75 % au moins des comits membres votants. Lattention est appele sur le fait que certains des lments du prsent document peuvent faire lobjet de droits de proprit intellectuelle ou de droits analogues. LISO ne saurait tre tenue pour responsable de ne pas avoir ident
9、ifi de tels droits de proprit et averti de leur existence. L Amendement 1 lISO 21571:2005 a t labor par le comit technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-comit SC 16, Mthodes horizontales pour lanalyse molculaire de biomarqueurs. ISO 2013 Tous droits rservs iii Produits alimentaires Mthodes
10、danalyse pour la dtection des organismes gntiquement modifis et des produits drivs Extraction des acides nucliques AMENDEMENT 1 Page v, Introduction Supprimer la rfrence lISO 21568. Remplacer la rfrence lISO 24276 par ce qui suit: ISO 24276:2006, Produits alimentaires Mthodes danalyse pour la dtecti
11、on des organismes gntiquement modifis et des produits drivs Exigences gnrales et dfinitions Page 1, Article 2 Remplacer la rfrence lISO 24276: par ce qui suit: ISO 24276:2006, Produits alimentaires Mthodes danalyse pour la dtection des organismes gntiquement modifis et des produits drivs Exigences g
12、nrales et dfinitions Supprimer la rfrence la note de bas de page 1) ainsi que la note de bas de page elle-mme. Supprimer la rfrence lISO 21568. Page 3, 5.1.1, alina 2, ligne 2 Supprimer par exemple 3 000 particules pour une limite de dtection de 0,1 %, afin de permettre une analyse statistiquement v
13、alable (voir lISO 21568). Page 3, 5.1.2, alina 1, ligne 2 Remplacer conformment aux procdures dcrites dans lISO 24276 par conformment la conception du laboratoire spcifie dans lISO 24276:2006, 5.3.2. Page 3, 5.1.2, alina 2 Remplacer le texte existant par Les chantillons de laboratoire doivent tre su
14、ffisamment homognes avant de les rduire ou broyer et avant de prlever la prise dessai. Page 3, 5.1.2, alina 4, lignes 4 et 7 Supprimer conformment lISO 21568.ISO 21571:2005/Amd.1:2013(F) ISO 2013 Tous droits rservs 1 ISO 21571:2005/Amd.1:2013(F) Page 3, 5.1.2, alina 8 Remplacer la premire phrase par
15、 Aprs ce traitement, homogniser lensemble de lchantillon de laboratoire. Page 5, 5.2.1, alina 7 Aprs la phrase Remettre lADN en solution dans leau ou dans une solution tampon qui vite la dgradation de lADN, insrer un exemple comme suit: EXEMPLE Un tampon tris/EDTA (TE, 1 ou 0,1) ajust pH 8,0 est app
16、ropri pour remettre lADN en solution ou le diluer. Page 5, 5.3.1, alina 1 Ajouter une nouvelle phrase la fin de lalina: Il convient de dterminer la quantit totale dADN utilis pour la PCR. La quantit totale dADN taxonomique cible doit galement tre considre car lADN taxonomique non cible peut affecter
17、 le rendement de la PCR. Page 6, Article 6, alina 2 Remplacer la phrase entre parenthses par (par exemple si lanalyse effectuer est une PCR, il convient dvaluer la qualit de lADN extrait en utilisant des contrles PCR appropris). Page 10, A.1.1.6.5 Remplacer 2)par 1)et renumroter la note de bas de pa
18、ge. Page 11, A.1.1.8 Remplacer 3)par 2)et renumroter la note de bas de page. Page 20, A.1.4.2, alina 2 Supprimer la phrase: Cette mthode applique aux fragments microbiens ou aux couches de myclium a t soumise des essais de validation interlaboratoires 17 . Page 35, aprs A.5.1.8, ajouter A.5.2 A.5.2
19、Mthode la guanidine - chloroforme: protocole pour lcithine de soja A.5.2.1 Objectif, pertinence et base scientifique La lcithine de soja est un ingrdient couramment utilis dans de nombreux produits alimentaires comme mulsifiant. Elle peut tre produite en utilisant du soja gntiquement modifi (GM) ou
20、non. La mthode dcrite ici permet dextraire lADN prsent dans lchantillon afin de procder des analyses ultrieures par PCR pour dtecter les squences dADN gntiquement modifies drives de sojas GM. La mthode est fonde sur la Rfrence 44, et un mode opratoire trs similaire a t valid dans le cadre dun essai
21、interlaboratoires ralis en Suisse. Lors de cette tude, la quantit dADN extrait a t dtermine par spectromtrie (Rfrence 35, section 1.3) des fins dinterprtation. LInstitut chimique et vtrinaire de Fribourg (Allemagne) a ralis un essai interlaboratoires complmentaire 2 ISO 2013 Tous droits rservs ISO 2
22、1571:2005/Amd.1:2013(F) avec 12 laboratoires participants et la quantit dADN de soja extractible et amplifiable a t dtermine par une PCR quantitative en temps rel. Pour les rsultats, voir la Rfrence 45. A.5.2.2 Domaine dapplication Cette mthode dcrit un mode opratoire pour extraire lADN des lcithine
23、s de soja des huiles vgtales brutes et presses froid. Si la teneur en ADN de lchantillon est faible, la technique de PCR en temps rel est utilise pour quantifier lADN isol partir dune prise dessai, et pour calculer la limite de dtection pratique qui peut tre obtenue lors de lanalyse par PCR de lADN
24、extrait. A.5.2.3 tat de validation et critres de performance A.5.2.3.1 Critres de validation La mthode dcrite dans le prsent paragraphe a t valide dans le cadre dun essai interlaboratoires en dterminant la quantit dADN de soja extractible et amplifiable par une PCR quantitative en temps rel. Ltude i
25、nterlaboratoires a t ralise selon le protocole IUPAC (Rfrence 46). A.5.2.3.2 Robustesse de la mthode La mthode a t utilise en routine pendant plus de 10 ans dans les laboratoires privs dessais sur les OGM et les laboratoires de contrle allemands et suisses, et aucun problme na t rapport. Bien quaucu
26、ne donne spcifique sur la robustesse (par exemple en modifiant les paramtres de la mthode) ne soit disponible, les expriences des laboratoires ont montr que de faibles variations des conditions naffectent pas les performances de la mthode. A.5.2.3.3 Essai intralaboratoire Les matriels utiliss dans l
27、e cadre de lessai interlaboratoires ont t soumis essai dans le laboratoire des dveloppeurs de la mthode afin de dterminer la fidlit intralaboratoire de la mthode. Pour estimer la fidlit de la mthode, cinq extractions dADN de chacune des cinq lcithines de soja ont t ralises et mesures par PCR en temp
28、s rel dans des conditions de rptabilit, en utilisant une mthode spcifique aux gnes de lcithine de soja, conformment lISO 21570:2005 41 , C.2. Les rsultats sont indiqus dans le Tableau A.6. Tableau A.6 Validation intralaboratoire de la mthode dextraction dADN avec cinq chantillons de lcithine de soja
29、 (n = 5 extractions chacun) chantillon de lcithine n Nombre moyen de copies de lectine cart-type de rptabilit, s rnombre de copies Coefficient de variation de rptabilit, C V,r% 1 20 464 5 367 26 2 3 203 620 19 3 2 005 306 15 4 6 978 331 5 5 14 8 61 Avant lessai interlaboratoires, lADN a t extrait de
30、 cinq lcithines de soja du commerce et leffet inhibiteur de PCR a t soumis essai. LADN prpar partir de chaque chantillon a t dilu dans un tampon TE (1 volume dADN dilu dans 4 volumes de TE; 1 volume de premire dilution dADN dilu dans 4 volumes de TE, 1 volume de seconde dilution dADN dilu dans 4 vol
31、umes de TE). Les prparations dADN taient exemptes dinhibiteurs de PCR car il sest avr que la diffrence entre la valeur C tcalcule (extrapole) de lchantillon non dilu dADN et la valeur C tmesure de chaque prparation dADN tait infrieure 0,1. ISO 2013 Tous droits rservs 3 ISO 21571:2005/Amd.1:2013(F) A
32、.5.2.3.4 Essai interlaboratoires Un essai interlaboratoires (tude de validation) a t ralis dans 12 laboratoires (Rfrence 45). Cinq chantillons de lcithine de soja du commerce ont t utiliss. Chaque laboratoire a reu 15 chantillons cods et un talon dADN pour ltalonnage. Les chantillons ont t rpartis d
33、e manire que chaque participant reoive trois chantillons identiques de chacune des cinq lcithines de soja. Chaque laboratoire a ralis une seule extraction dADN par chantillon. Les rsultats remis ont t affects aux cinq chantillons diffrents de lcithine pour lvaluation de lessai interlaboratoires. Les
34、 ADN extraits ont t soumis essai par PCR en temps rel en amplifiant une squence dADN du gne de lectine de soja conformment la mthode lISO 21570:2005 41 , C.2. Ltalon dADN pour ltalonnage a t prpar partir de farine de soja ERM BF410a 3) en utilisant le Plant Mini Kit 3)(Qiagen, Hilden/Allemagne) et e
35、n dbutant par une extraction au CTAB (voir A.3). La concentration dADN a t estime par la mthode de fluoromtrie PicoGreen 3)dsDNA (Rfrence 17). Les talons dADN ont t dfinis par le nombre de copies (cp) en quivalents gnome haplode par microlitre. Pour les calculs, la masse suppose de gnome haplode du
36、soja tait de 1,13 pg. Une srie de dilutions a t ralise, variant de 50 000 cp/5 l environ 80 cp/5 l. Sept laboratoires ont utilis des quipements de PCR en temps rel ABI 3)(ABI 7000, 7500, 7700), et cinq laboratoires ont utilis le Light Cycler 3)(Roche) en apportant les modifications suivantes au prot
37、ocole dcrit dans lISO 21570:2005 41 , C.2: la PCR a t ralise dans un volume final de 20 l contenant le mlange matre PCR QuantiTect Probe 3)(Qiagen), les amorces GM1-F et GM1-R 500 nmol/l chacune et 150 nmol/l de sonde GM1. Le programme de PCR en temps rel tait: tape initiale de 900 s 95 C, puis 45 c
38、ycles de 10 s 95 C, 30 s 60 C et 30 s 72 C. Les signaux de fluorescence ont t acquis ltape dlongation. La vitesse de la rampe de temprature tait fixe 2 C/s. Pour vrifier ladquation de la mthode, la limite de dtection pratique, LOD prac , a t dtermine pour le soja gntiquement modifi, conformment lISO
39、 24276. La valeur a t calcule individuellement pour chaque chantillon laide de la Formule (A.1): c(A.1) o LOD abs est la LOD de la mthode PCR en temps rel spcifique lvnement et utilise pour la quantification, en copies par PCR; NOTE Pour les calculs du Tableau A.7, une LOD de 10 copies est suppose.
40、c s, DNA est la quantit dADN de soja amplifiable dans lchantillon, en copies par PCR, dtermine par la mthode PCR en temps rel spcifique un gne de rfrence du soja. Le Tableau A.7 rcapitule les rsultats de lessai interlaboratoires. Dans quatre chantillons de lcithine sur cinq, des valeurs moyennes de
41、LOD pracinfrieures 0,9 % (exemple pour un seuil lgislatif en vigueur) ont t obtenues. Pour lchantillon de lcithine n 2, la LOD practait suprieure 0,9 % dans un seul laboratoire, pour lchantillon de lcithine n 3 dans deux laboratoires. Pour lchantillon de lcithine n 5, tous les laboratoires ont ampli
42、fi moins de 80 copies du gne de lectine et, par consquent, une LOD pracinfrieure ou gale 0,9 % na pas pu tre obtenue. De plus, les coefficients de variation de reproductibilit ont t calculs pour les nombres de copies de lectine rapports pour les cinq chantillons de lcithine. Au total, les donnes de
43、PCR en temps rel de 36 extractions par chantillon de lcithine ont t utilises pour lvaluation. Aucune valeur aberrante na t limine pour calculer le coefficient de variation de reproductibilit, C V,R . Pour lchantillon n 5, aucune donne concernant la fidlit na pu tre dtermine en raison de la faible qu
44、antit de copies de lectine infrieures la LOQ de la mthode. Il faut noter que les donnes relatives la fidlit refltent le coefficient de variation de reproductibilit 3) Produit disponible sur le march. Cette information est donne lintention des utilisateurs du prsent document et ne signifie nullement
45、que lISO approuve ou recommande lemploi exclusif du produit ainsi dsign. Des produits quivalents peuvent tre utiliss sil est dmontr quils conduisent aux mmes rsultats.4 ISO 2013 Tous droits rservs ISO 21571:2005/Amd.1:2013(F) des nombres de copies extraites des chantillons de lcithine, dans les cond
46、itions de reproductibilit de lessai interlaboratoires. Tableau A.7 Rsum des donnes de validation chantillon de lci- thine n Nombre moyen de copies de lectine Coefficient de variation de repro- ductibilit C V,R % Limite de dtec- tion pratique moyenne LOD prac% Nombre de labora- toires avec LOD prac10 0/12 A.5.2.4 Principe et rsum Lchantillon visqueux est homognis aprs chauffage et extrait laide dhexane aprs addition dun tampon de thiocyanate de guanidine. Les substances susceptibles de perturber lanalyse sont spares par extraction laide de c
