1、 Numro de rfrence ISO 18395:2005(F) ISO 2005NORME INTERNATIONALE ISO 18395 Premire dition 2005-04-15Corps gras dorigines animale et vgtale Dtermination de la teneur en monoacylglycrides, en diacylglycrides, en triacylglycrides et en glycrol par chromatographie dexclusion haute performance (CLHP dexc
2、lusion) Animal and vegetable fats and oils Determination of monoacylglycerols, diacylglycerols, triacylglycerols and glycerol by high- performance size-exclusion chromatography (HPSEC) ISO 18395:2005(F) PDF Exonration de responsabilit Le prsent fichier PDF peut contenir des polices de caractres intg
3、res. Conformment aux conditions de licence dAdobe, ce fichier peut tre imprim ou visualis, mais ne doit pas tre modifi moins que lordinateur employ cet effet ne bnficie dune licence autorisant lutilisation de ces polices et que celles-ci y soient installes. Lors du tlchargement de ce fichier, les pa
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6、dutilisation, veuillez en informer le Secrtariat central ladresse donne ci-dessous. DOCUMENT PROTG PAR COPYRIGHT ISO 2005 Droits de reproduction rservs. Sauf prescription diffrente, aucune partie de cette publication ne peut tre reproduite ni utilise sous quelque forme que ce soit et par aucun procd
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8、iso.org Version franaise parue en 2007 Publi en Suisse ii ISO 2005 Tous droits rservsISO 18395:2005(F) ISO 2005 Tous droits rservs iii Avant-propos LISO (Organisation internationale de normalisation) est une fdration mondiale dorganismes nationaux de normalisation (comits membres de lISO). Llaborati
9、on des Normes internationales est en gnral confie aux comits techniques de lISO. Chaque comit membre intress par une tude a le droit de faire partie du comit technique cr cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec lISO participent galement
10、 aux travaux. LISO collabore troitement avec la Commission lectrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation lectrotechnique. Les Normes internationales sont rdiges conformment aux rgles donnes dans les Directives ISO/CEI, Partie 2. La tche principale des comits techniques est
11、 dlaborer les Normes internationales. Les projets de Normes internationales adopts par les comits techniques sont soumis aux comits membres pour vote. Leur publication comme Normes internationales requiert lapprobation de 75 % au moins des comits membres votants. Lattention est appele sur le fait qu
12、e certains des lments du prsent document peuvent faire lobjet de droits de proprit intellectuelle ou de droits analogues. LISO ne saurait tre tenue pour responsable de ne pas avoir identifi de tels droits de proprit et averti de leur existence. LISO 18395 a t labore par le comit technique ISO/TC 34,
13、 Produits alimentaires, sous-comit SC 11, Corps gras dorigines animale et vgtale. NORME INTERNATIONALE ISO 18395:2005(F) ISO 2005 Tous droits rservs 1 Corps gras dorigines animale et vgtale Dtermination de la teneur en monoacylglycrides, en diacylglycrides, en triacylglycrides et en glycrol par chro
14、matographie dexclusion haute performance (CLHP dexclusion) 1 Domaine dapplication La prsente Norme internationale spcifie une mthode permettant de dterminer la teneur en monoacylglycrides, en diacylglycrides, en triacylglycrides et en glycrol libre par chromatographie liquide dexclusion haute perfor
15、mance. Elle sapplique aux produits (par exemple les mulsifiants) renfermant comme constituants principaux des monoacylglycrides et des diacylglycrides une concentration suprieure 10 % ainsi que des triacylglycrides une teneur infrieure 20 %. La mthode ne sapplique pas aux corps gras laitiers ou aux
16、corps gras et aux huiles ayant une gamme tendue dacides gras, car les diacylglycrides prsents dans les acides gras chane courte peuvent avoir une masse molculaire infrieure celle des monoacylglycrides prsents dans les acides gras chane longue. Lapplication de la mthode est limite ce qui concerne les
17、 mlanges glycridiques base dacides caprylique et caprique. Dans ceux-ci, seule la teneur en monoacylglycrides et en glycrol libre peut tre dtermine. NOTE Les Rfrences de 1 4 fournissent des informations de base. 2 Rfrences normatives Les documents de rfrence suivants sont indispensables pour lapplic
18、ation du prsent document. Pour les rfrences dates, seule ldition cite sapplique. Pour les rfrences non dates, la dernire dition du document de rfrence sapplique (y compris les ventuels amendements). ISO 661, Corps gras dorigines animale et vgtale Prparation de lchantillon pour essai 3 Termes et dfin
19、itions Pour les besoins de la prsente Norme internationale, les termes et dfinitions suivants sappliquent. 3.1 teneurs en monoacylglycrides, diacylglycrides, triacylglycrides et glycrol proportion des monoacylglycrides, diacylglycrides, triacylglycrides et glycrol, dtermine dans les conditions de la
20、 prsente Norme internationale NOTE La teneur est exprime sous forme de fraction massique (grammes pour 100 g) ou en pourcentage de tous les pics. ISO 18395:2005(F) 2 ISO 2005 Tous droits rservs4 Principe Dissolution de lchantillon dans du ttrahydrofurane (THF). Analyse de la solution obtenue par chr
21、omatographie par permation de gel (GPC) en utilisant le THF comme phase mobile. Sparation ce stade des triacylglycrides et du glycrol en fonction de leur masse molculaire. Dtection au moyen dun dtecteur indice de rfraction. 5 Ractifs AVERTISSEMENT Lattention est attire sur les rglementations concern
22、ant la manipulation des substances dangereuses. Des mesures techniques, organisationnelles et de protection individuelle doivent tre respectes. Sauf spcification contraire, nutiliser que des ractifs de qualit analytique reconnue. 5.1 Ttrahydrofurane (THF), stabilis avec 250 l/l dhydroxytolune butyl
23、(BHT). 5.2 Produits talons. 5.2.1 Glycrol (w W 99,5 %). 5.2.2 Monoacylglycrides, diacylglycrides et triacylglycrides 1) . Il est recommand que les talons utiliss soient des monoacylglycrides, des diacylglycrides et des triacylglycrides ayant une rpartition dacides gras aussi comparable que possible
24、celle des acides gras prsents dans lchantillon. Cependant, il nest pas ncessaire de reproduire lidentique la composition glycridique. Pour la majorit des chantillons, du monopalmitate et/ou du monostarate et/ou du monoolate, du dipalmitate et/ou du distarate et/ou du diolate, du tripalmitate et/ou d
25、u tristarate et/ou du triolate suffisent. Les facteurs de rponse pour le glycrol, les monoacylglycrides, les diacylglycrides et les triacylglycrides sont gnralement identiques dans les conditions indiques dans la prsente Norme internationale; par consquent, dans la plupart des cas, il est inutile du
26、tiliser des solutions de rfrence quantitatives, les pourcentages en surface pouvant tre employs. Il est cependant ncessaire de dterminer un facteur de rponse pour le glycrol lorsque la concentration dans lchantillon est suprieure 3 %. La Pharmacope europenne nutilise aucun facteur de rponse pour les
27、 acylglycrols. Cela doit tre indiqu dans le rapport danalyse. 6 Appareillage Matriel courant de laboratoire et, en particulier, les matriels suivants. 6.1 Balance analytique, ayant une prcision de lecture de 0,1 mg. 6.2 Fiole jauge, de capacit 10 ml. 6.3 Pipette, de capacit 5 ml. 6.4 Bain ultrasons.
28、 6.5 Pompe CLHP/GPC. 1) Disponible auprs de Sigma-Aldrich (http:/). Cette information est donne par souci de commodit lintention des utilisateurs de la prsente Norme internationale et ne saurait constituer un engagement de lISO lgard de ces produits. ISO 18395:2005(F) ISO 2005 Tous droits rservs 3 6
29、.6 Injecteur, muni dune boule dinjection de capacit 20 l. 6.7 Dtecteur, rfractomtre diffrentiel (dtecteur indice de rfraction). 6.8 Colonne GPC combine, ayant une plage utile de masse molculaire allant jusqu 4 000 Da, (par exemple trois colonnes Plgel de 300 mm 7,5 mm 2) , 5 m, 100 ). Il est galemen
30、t possible dutiliser dautres colonnes (ou combinaisons de colonnes) du moment que la sparation des monoacylglycrides et diacylglycrides et galement des diacylglycrides et triacylglycrides est garantie. Pour obtenir la sparation requise, lutilisation de deux colonnes seulement est galement possible.
31、6.9 Four (thermostat de colonne). 6.10 Systme dintgration et dvaluation des donnes. 7 chantillonnage Il est important que le laboratoire reoive un chantillon rellement reprsentatif nayant pas subi de dommage ou de modification au cours du transport ou du stockage. Lchantillonnage ne fait pas partie
32、de la mthode spcifie dans la prsente Norme internationale. Une mthode dchantillonnage prconise figure dans lISO 5555 5 . 8 Prparation de lchantillon pour essai Prparer lchantillon conformment lISO 661. Avant de prlever la prise dessai dans lchantillon, bien mlanger lchantillon pour en assurer lhomog
33、nit. Pour le mme motif, faire fondre entirement les chantillons solides en vue dun mlange correct. 9 Mode opratoire 9.1 Prparation de la solution de dosage Peser, 0,1 mg prs, environ 100 mg de lchantillon et introduire dans une fiole jauge de 10 ml. Consigner la concentration en milligrammes dchanti
34、llon/10 ml. Aprs avoir complt au trait avec du ttrahydrofurane (THF), placer la fiole dans le bain ultrasons pendant environ 5 min 10 min. Injecter directement la solution limpide obtenue dans le systme GPC. 9.2 Prparation des solutions de rfrence Peser, 0,1 mg prs, des quantits de glycrol, de monoa
35、cylglycrides, de diacylglycrides et de triacylglycrides suprieures et infrieures la concentration que lon sattend trouver dans lchantillon et les introduire dans des fioles jauges de 10 ml. Aprs avoir complt au trait avec du ttrahydrofurane (THF), placer les fioles dans le bain ultrasons pendant env
36、iron 5 min 10 min. Injecter directement les solutions limpides obtenues dans le systme GPC. 2) Disponible par exemple auprs de Polymer Laboratories (http:/). Cette information est donne par souci de commodit lintention des utilisateurs de la prsente Norme internationale et ne saurait constituer un e
37、ngagement de lISO lgard de ces produits. ISO 18395:2005(F) 4 ISO 2005 Tous droits rservsConsigner la concentration en milligrammes de composant/10 ml pour chaque solution de rfrence. Si la teneur attendue nest pas connue, il est possible de confectionner un certain nombre de solutions dtalonnage qui
38、 couvrent une plage plus tendue. NOTE Se rfrer 5.2.2. 9.3 Chromatographie par permation de gel (GPC) Rgler le systme GPC de la manire suivante: Volume dinjection: 20 l Colonnes de sparation: Plage: Minimum 0 Da 4 000 Da (6.8) Temprature du four: 35 C ou 40 C 0,1 C Dbit: 0,8 ml/min 1,0 ml/min Dtecteu
39、r indice de rfraction: Temprature: 35 C ou 40 C. Des chromatogrammes types obtenus dans ces conditions sont illustrs dans lAnnexe A. Effectuer des essais qualitatifs pour dterminer la prsence de monoacylglycrides, diacylglycrides et triacylglycrides ainsi que de glycrol en comparant les temps de rte
40、ntion avec des substances comparatives (par exemple monoacylglycrides-C18 / diacylglycrides-C18 / triacylglycrides-C18) ou des groupes dacylglycrols. Pour la dtermination quantitative des teneurs, prparer au moins deux solutions dtalonnage. Choisir la concentration des solutions de sorte quelles enc
41、adrent les teneurs suprieure et infrieure de lchantillon. Injecter ces solutions lune aprs lautre, deux fois dans chaque cas. Les courbes dtalonnage obtenues permettent de calculer les concentrations en glycrol et en acylglycrol dans lchantillon. NOTE Se rfrer 5.2.2. 10 Calcul La teneur en glycrol,
42、w G , de lchantillon, exprime en pourcentage en masse, est calcule de la manire suivante: GG G S 100 % mF w m = o w Gest la teneur en glycrol de lchantillon; m Gest la masse, en milligrammes, du glycrol prsent dans lchantillon, calcule partir de la courbe dtalonnage; m Sest la masse, en milligrammes
43、, de la prise dessai; F Gest le facteur de rponse obtenu pour le glycrol. Les teneurs en monoacylglycrides, diacylglycrides et triacylglycrides sont calcules de la mme manire. Lors de lvaluation de la surface des pics, une ligne de base horizontale est utilise comme limite dintgration. ISO 18395:200
44、5(F) ISO 2005 Tous droits rservs 5 Les facteurs de rponse pour le glycrol, les monoacylglycrides, les diacylglycrides et les triacylglycrides sont gnralement identiques dans les conditions indiques ici; par consquent, dans la plupart des cas, il est inutile dutiliser des solutions de rfrence quantit
45、atives et les facteurs de rponse sont supposs tre F = 1. Il est cependant ncessaire de dterminer un facteur de rponse pour le glycrol lorsque la concentration dans lchantillon est suprieure 3 %. Dans la plupart des cas, les acides gras libres ne sont pas spars du groupe des pics des monoacylglycride
46、s. Donc dans des chantillons ayant un indice dacidit 1, la quantit dacides gras, calcule partir de lindice dacidit, peut tre soustraite de la teneur en monoacylglycrides. Cela doit tre consign dans le rapport danalyse. Le rsultat de la dtermination, exprim en pourcentage en masse, est donn avec une
47、dcimale. 11 Fidlit 11.1 Essai interlaboratoires Les dtails dun essai interlaboratoires relatif la fidlit de la mthode sont rsums dans lAnnexe B. Il se peut que les valeurs obtenues suite cet essai interlaboratoires ne sappliquent pas dautres matrices et plages de concentration que celles mentionnes. 11.2 Rptabilit La diffrence absolue entre deux rsultats dessai individuels
