1、 Numro de rfrence ISO 16050:2003(F) ISO 2003NORME INTERNATIONALE ISO 16050 Premire dition 2003-09-01Produits alimentaires Dosage de laflatoxine B 1et dtermination de la teneur totale en aflatoxines B 1 , B 2 , G 1et G 2 dans les crales, les fruits coque et les produits drivs Mthode par chromatograph
2、ie liquide haute performance Foodstuffs Determination of aflatoxin B 1 , and the total content of aflatoxins B 1 , B 2 , G 1and G 2in cereals, nuts and derived products High-performance liquid chromatographic method ISO 16050:2003(F) PDF Exonration de responsabilit Le prsent fichier PDF peut conteni
3、r des polices de caractres intgres. Conformment aux conditions de licence dAdobe, ce fichier peut tre imprim ou visualis, mais ne doit pas tre modifi moins que lordinateur employ cet effet ne bnficie dune licence autorisant lutilisation de ces polices et que celles-ci y soient installes. Lors du tlc
4、hargement de ce fichier, les parties concernes acceptent de fait la responsabilit de ne pas enfreindre les conditions de licence dAdobe. Le Secrtariat central de lISO dcline toute responsabilit en la matire. Adobe est une marque dpose dAdobe Systems Incorporated. Les dtails relatifs aux produits log
5、iciels utiliss pour la cration du prsent fichier PDF sont disponibles dans la rubrique General Info du fichier; les paramtres de cration PDF ont t optimiss pour limpression. Toutes les mesures ont t prises pour garantir lexploitation de ce fichier par les comits membres de lISO. Dans le cas peu prob
6、able o surviendrait un problme dutilisation, veuillez en informer le Secrtariat central ladresse donne ci-dessous. DOCUMENT PROTG PAR COPYRIGHT ISO 2003 Droits de reproduction rservs. Sauf prescription diffrente, aucune partie de cette publication ne peut tre reproduite ni utilise sous quelque forme
7、 que ce soit et par aucun procd, lectronique ou mcanique, y compris la photocopie et les microfilms, sans laccord crit de lISO ladresse ci-aprs ou du comit membre de lISO dans le pays du demandeur. ISO copyright office Case postale 56 CH-1211 Geneva 20 Tel. + 41 22 749 01 11 Fax + 41 22 749 09 47 E-
8、mail copyrightiso.org Web www.iso.org Version franaise parue en 2011 Publi en Suisse ii ISO 2003 Tous droits rservsISO 16050:2003(F) ISO 2003 Tous droits rservs iiiSommaire Page Avant-propos .iv 1 Domaine dapplication 1 2 Rfrences normatives.1 3 Principe 1 4 Ractifs.1 5 Appareillage .4 6 Mode oprato
9、ire.5 6.1 Gnralits .5 6.2 Extraction .6 6.3 Purification.6 6.4 Conditions de fonctionnement de la CLHP 6 6.5 Identification 7 6.6 Courbe dtalonnage.7 6.7 Dtermination 7 7 Calcul des rsultats.7 8 Fidlit 8 8.1 Essai interlaboratoires8 8.2 Rptabilit 8 8.3 Reproductibilit .9 9 Rapport dessai10 Annexe A
10、(informative) Rsultats de lessai interlaboratoires.11 Bibliographie.13 ISO 16050:2003(F) iv ISO 2003 Tous droits rservsAvant-propos LISO (Organisation internationale de normalisation) est une fdration mondiale dorganismes nationaux de normalisation (comits membres de lISO). Llaboration des Normes in
11、ternationales est en gnral confie aux comits techniques de lISO. Chaque comit membre intress par une tude a le droit de faire partie du comit technique cr cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec lISO participent galement aux travaux. LI
12、SO collabore troitement avec la Commission lectrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation lectrotechnique. Les Normes internationales sont rdiges conformment aux rgles donnes dans les Directives ISO/CEI, Partie 2. La tche principale des comits techniques est dlaborer les No
13、rmes internationales. Les projets de Normes internationales adopts par les comits techniques sont soumis aux comits membres pour vote. Leur publication comme Normes internationales requiert lapprobation de 75 % au moins des comits membres votants. Lattention est appele sur le fait que certains des l
14、ments du prsent document peuvent faire lobjet de droits de proprit intellectuelle ou de droits analogues. LISO ne saurait tre tenue pour responsable de ne pas avoir identifi de tels droits de proprit et averti de leur existence. LISO 16050 a t labore par le comit technique ISO/TC 34, Produits alimen
15、taires. Elle est base sur lEN 12955:1999 labore par le comit technique CEN/TC 275, Analyse alimentaire Mthodes horizontales. NORME INTERNATIONALE ISO 16050:2003(F) ISO 2003 Tous droits rservs 1Produits alimentaires Dosage de laflatoxine B 1et dtermination de la teneur totale en aflatoxines B 1 , B 2
16、 , G 1et G 2dans les crales, les fruits coque et les produits drivs Mthode par chromatographie liquide haute performance AVERTISSEMENT Lutilisation de la prsente Norme internationale peut impliquer lemploi de produits et la mise en uvre de modes opratoires et dappareillages caractre dangereux. La pr
17、sente Norme internationale na pas pour but daborder tous les problmes de scurit lis son utilisation. Il incombe lutilisateur de la prsente Norme internationale dtablir, avant de lutiliser, des pratiques dhygine et de scurit appropries et de dterminer lapplicabilit des restrictions rglementaires. 1 D
18、omaine dapplication La prsente Norme internationale spcifie une mthode par chromatographie liquide haute performance en phase inverse, avec purification sur colonne dimmunoaffinit et drivation post-colonne, pour le dosage des aflatoxines dans les crales, les fruits coque et les produits drivs. La li
19、mite de quantification de laflatoxine B 1et de la somme des aflatoxines B 1 , B 2 , G 1et G 2est de 8 g/kg. Cette mthode a t valide sur du mas, du beurre darachide et des arachides brutes ayant respectivement une teneur en aflatoxines totales de 24,5 g/kg, 8,4 g/kg et 16 g/kg. Il a galement t dmontr
20、 que la prsente mthode peut tre utilise pour les produits olagineux, les fruits secs et les produits drivs. 2 Rfrences normatives Les documents de rfrence suivants sont indispensables pour lapplication du prsent document. Pour les rfrences dates, seule ldition cite sapplique. Pour les rfrences non d
21、ates, la dernire dition du document de rfrence sapplique (y compris les ventuels amendements). ISO 3696:1987, Eau pour laboratoire usage analytique Spcification et mthodes dessai 3 Principe Lchantillon pour essai est extrait avec un mlange deau et de mthanol. Lextrait dchantillon est filtr, dilu ave
22、c de leau et dpos sur une colonne dimmunoaffinit contenant des anticorps spcifiques des aflatoxines B 1 , B 2 , G 1et G 2 . Les aflatoxines sont isoles, purifies et concentres sur la colonne, puis libres des anticorps avec du mthanol. Les aflatoxines sont quantifies par chromatographie liquide haute
23、 performance (CLHP) en phase inverse avec dtection par fluorescence et drivation post-colonne. 4 Ractifs Sauf indication contraire, utiliser uniquement des ractifs de qualit analytique reconnue. 4.1 Eau, de qualit 1 selon lISO 3696:1987. ISO 16050:2003(F) 2 ISO 2003 Tous droits rservs4.2 Chlorure de
24、 sodium. 4.3 Iode, cristalline, ou en alternative, hydrobromure perbromure de pyridium (PBPB) 1) . 4.4 Aflatoxine, sous forme de cristaux ou de film en ampoule. AVERTISSEMENT Les aflatoxines sont cancrignes pour lhomme. Lattention est attire sur les recommandations du Centre international de recherc
25、he sur le cancer de lOMS (voir Rfrences 1 et 2). Protger de manire adquate le laboratoire o sont effectues les analyses de la lumire du jour. Pour y parvenir efficacement, il est possible dutiliser une feuille absorbant les ultraviolets (UV) place sur les fentres, associe une lumire tamise (pas de l
26、umire solaire directe), ou des rideaux ou des stores associs une lumire artificielle (les tubes fluorescents sont acceptables). 4.5 Actonitrile, de qualit pour CLHP. 4.6 Mthanol, de qualit pour analyse. 4.7 Mthanol, de qualit pour CLHP. 4.8 Tolune, de qualit pour analyse. AVERTISSEMENT Le tolune est
27、 trs inflammable et nocif. La prparation des talons avec ce solvant doit tre effectue sous une hotte aspirante. Les oprations ralises hors de la hotte, telles que le mesurage des talons par spectromtrie UV, doivent se faire en plaant les talons dans des rcipients ferms. 4.9 Mlange tolune/actonitrile
28、 Mlanger 98 parties en volume de tolune (4.8) avec 2 parties en volume dactonitrile (4.5) (voir lAvertissement en 4.8). 4.10 Solvant dextraction Mlanger 7 parties en volume de mthanol (4.6) avec 3 parties en volume deau (4.1). Dautres mlanges de solvant dextraction, compatibles avec la phase mobile,
29、 peuvent galement tre utiliss condition quil ait t prouv quils sont plus efficaces ou quils aient t recommands par le fabricant de la colonne dimmunoaffinit (IA). 4.11 Phase mobile Mlanger 3 parties en volume deau (4.1) avec 1 partie en volume dactonitrile (4.5) et 1 partie en volume de mthanol (4.7
30、). Dgazer la solution avant de lutiliser. 4.12 Ractif de drivation post-colonne Dissoudre 100 mg diode (4.3) dans 2 ml de mthanol (4.6). Ajouter 200 ml deau (4.1), agiter pendant 1 h puis filtrer avec un filtre membrane (5.8) de 0,45 m de porosit. Prparer la solution la semaine mme de lutilisation e
31、t la conserver lobscurit ou dans un flacon en verre brun. Agiter la solution pendant 10 min avant utilisation. En guise dalternative, dissoudre 50 mg de PBPB (4.3) dans 1 000 ml deau. Cette solution peut tre utilise pendant 4 jours si elle est conserve dans lobscurit temprature ambiante. 1) CAS: 394
32、16-48-3 (CAS = Chemical Abstracts Service). ISO 16050:2003(F) ISO 2003 Tous droits rservs 34.13 Solutions mres daflatoxines B 1 , B 2 , G 1et G 2AVERTISSEMENT Dans la mesure du possible, protger les solutions daflatoxines de la lumire (les conserver dans lobscurit, utiliser une feuille daluminium ou
33、 de la verrerie ambre). Dissoudre de laflatoxine B 1 , B 2 , G 1et G 2sparment dans le mlange tolune/actonitrile (4.9) afin dobtenir des solutions spares contenant 10 g/ml. Pour dterminer la concentration exacte daflatoxine dans chaque solution mre, enregistrer le spectre dabsorption une longueur do
34、nde comprise entre 330 nm et 370 nm dans des cuves en quartz de 1 cm (5.7) au moyen dun spectromtre (5.6), en utilisant le mlange tolune/actonitrile (4.9) comme rfrence. Calculer la concentration de chaque aflatoxine, i , en microgrammes par millilitre, laide de lquation (1): max 1000 i i i AM d = (
35、1) o A maxest labsorbance dtermine au maximum du spectre dabsorption; M iest la masse molculaire de chaque aflatoxine, en grammes; iest le coefficient dabsorption molaire de chaque aflatoxine dans le mlange tolune/actonitrile; NOTE Cette valeur est dtermine dans une solution contenant c = 1 mol/l da
36、flatoxine et dans une cuve de trajet optique d = 1 cm. Le coefficient dabsorption molaire ( ) est gnralement indiqu sans unit de mesure, mais lquation A = c d permet dobtenir lunit suivante: l mol 1 cm 1 . d est le trajet optique de la cuve, en centimtres. M iet isont indiqus dans le Tableau 1. Tabl
37、eau 1 Masse molculaire et coefficient dabsorption molaire des aflatoxines B 1 , B 2 , G 1et G 2Aflatoxine M i iB 1312 19 300 B 2314 20 400 G 1328 16 600 G 2330 17 900 NOTE Un mlange de tolune et dactonitrile (98 + 2) est utilis comme solvant. 4.14 Solution mre daflatoxines mlanges Prparer une soluti
38、on mre contenant 500 ng/ml daflatoxine B 1 , 125 ng/ml daflatoxine B 2 , 250 ng/ml daflatoxine G 1et 125 ng/ml daflatoxine G 2dans le mlange tolune/actonitrile (4.9). Lorsque la solution doit tre conserve, peser le rcipient avant le stockage. Envelopper soigneusement le rcipient avec une feuille dal
39、uminium et le conserver environ 4 C. Immdiatement avant usage, peser nouveau le rcipient et enregistrer toute variation de masse survenue aprs stockage. NOTE Une exposition normale aux rayons UV lors du mesurage de labsorbance nentrane pas de conversion observable en photoproduits. ISO 16050:2003(F)
40、 4 ISO 2003 Tous droits rservs4.15 Solution talon daflatoxines mlanges Transvaser chaque quantit spcifie dans le Tableau 2 de la solution mre daflatoxines mlanges (4.14) dans une srie de quatre fioles jauges de 2 ml (5.5). vaporer les solutions jusqu siccit sous un flux dazote temprature ambiante. A
41、jouter 1 ml de mthanol (4.6) dans chaque fiole. Dissoudre le rsidu sec, diluer la solution jusquau trait avec de leau (4.1) et mlanger. Prparer la solution le jour de lutilisation. Tableau 2 Prparation des solutions talons Solution talon Volume prlev sur la solution mre Concentration daflatoxine ng/
42、ml l B 1B 2G 1G 21 60 15,0 3,75 7,50 3,75 2 40 10,0 2,50 5,00 2,50 3 20 5,00 1,25 2,50 1,25 4 10 2,50 0,625 1,25 0,625 NOTE Les valeurs indiques sont donnes titre indicatif. La gamme talon couvre les concentrations des chantillons. 4.16 Acide sulfurique, c(H 2 SO 4 ) = 2 mol/l. 5 Appareillage Plonge
43、r la verrerie de laboratoire entrant en contact avec les solutions aqueuses daflatoxines dans de lacide sulfurique (4.16) pendant plusieurs heures, puis bien la rincer leau (trois fois par exemple) afin dliminer toute trace dacide. Vrifier labsence dacide avec du papier pH. NOTE Ce traitement est nc
44、essaire car lutilisation de verrerie nayant pas subi de lavage lacide peut occasionner des pertes daflatoxines. En pratique, ce traitement est ncessaire pour les ballons fond rond, les fioles jauges, les prouvettes gradues pied, les flacons ou les tubes utiliss pour les solutions dtalonnage et les e
45、xtraits finaux (en particulier les passeurs automatiques dchantillon), ainsi que pour les pipettes Pasteur lorsquelles sont utilises pour transvaser les solutions dtalonnage ou les extraits. Appareillage courant de laboratoire et, en particulier, ce qui suit. 5.1 Colonne dimmunoaffinit (IA) La colon
46、ne dIA contient des anticorps dirigs contre les aflatoxines B 1 , B 2 , G 1et G 2 . La capacit minimale de liaison de la colonne ne doit pas tre infrieure 100 ng daflatoxine B 1 . La rcupration pour les aflatoxines B 1 , B 2et G 1ne doit pas tre infrieure 80 %, et 60 % pour laflatoxine G 2 , lorsquo
47、n applique sur la colonne dIA une solution talon de 5 ng de chaque toxine dans 15 ml dun mlange de mthanol et deau 1 partie en volume de mthanol (4.6) et 3,4 parties en volume deau (4.1). Il convient que la colonne dIA comprenne un rservoir de solvant appropri (par exemple une seringue avec un adaptateur). Il est conseill de raliser les expriences de rcupration sur chaque matrice pour laquelle la mthode est utilise. 5.2 Broyeur,
