1、 Numro de rfrence ISO 15788-2:2003(F) ISO 2003NORME INTERNATIONALE ISO 15788-2 Premire dition 2003-02-15Corps gras dorigines animale et vgtale Dosage des stigmastadines dans les huiles vgtales Partie 2: Mthode par chromatographie liquide haute performance (CLHP) Animal and vegetable fats and oils De
2、termination of stigmastadienes in vegetable oils Part 2: Method using high-performance liquid chromatography (HPLC) ISO 15788-2:2003(F) PDF Exonration de responsabilit Le prsent fichier PDF peut contenir des polices de caractres intgres. Conformment aux conditions de licence dAdobe, ce fichier peut
3、tre imprim ou visualis, mais ne doit pas tre modifi moins que lordinateur employ cet effet ne bnficie dune licence autorisant lutilisation de ces polices et que celles-ci y soient installes. Lors du tlchargement de ce fichier, les parties concernes acceptent de fait la responsabilit de ne pas enfrei
4、ndre les conditions de licence dAdobe. Le Secrtariat central de lISO dcline toute responsabilit en la matire. Adobe est une marque dpose dAdobe Systems Incorporated. Les dtails relatifs aux produits logiciels utiliss pour la cration du prsent fichier PDF sont disponibles dans la rubrique General Inf
5、o du fichier; les paramtres de cration PDF ont t optimiss pour limpression. Toutes les mesures ont t prises pour garantir lexploitation de ce fichier par les comits membres de lISO. Dans le cas peu probable o surviendrait un problme dutilisation, veuillez en informer le Secrtariat central ladresse d
6、onne ci-dessous. ISO 2003 Droits de reproduction rservs. Sauf prescription diffrente, aucune partie de cette publication ne peut tre reproduite ni utilise sous quelque forme que ce soit et par aucun procd, lectronique ou mcanique, y compris la photocopie et les microfilms, sans laccord crit de lISO
7、ladresse ci-aprs ou du comit membre de lISO dans le pays du demandeur. ISO copyright office Case postale 56 CH-1211 Geneva 20 Tel. + 41 22 749 01 11 Fax. + 41 22 749 09 47 E-mail copyrightiso.org Web www.iso.org Publi en Suisse ii ISO 2003 Tous droits rservsISO 15788-2:2003(F) ISO 2003 Tous droits r
8、servs iiiSommaire Page Avant-propos. iv 1 Domaine dapplication 1 2 Rfrences normatives. 1 3 Termes et dfinitions 1 4 Principe 2 5 Ractifs 2 6 Appareillage. 3 7 chantillonnage 4 8 Prparation de lchantillon pour essai 4 8.1 Gnralits. 4 8.2 Mthode avec talon externe. 4 8.3 Mthode avec talon interne 5 9
9、 Mode opratoire 5 9.1 Chromatographie liquide haute performance (CLHP) 5 9.2 Identification des stradines . 5 10 Expression des rsultats 6 10.1 Mthode avec talon externe. 6 10.2 Mthode avec talon interne 6 11 Fidlit 7 11.1 Essai interlaboratoire . 7 11.2 Rptabilit 7 11.3 Reproductibilit. 7 12 Rappor
10、t dessai . 7 Annexe A (informative) Rsultats de lessai interlaboratoire. 8 Annexe B (informative) Exemples de chromatogrammes 9 Bibliographie 10 ISO 15788-2:2003(F) iv ISO 2003 Tous droits rservsAvant-propos LISO (Organisation internationale de normalisation) est une fdration mondiale dorganismes na
11、tionaux de normalisation (comits membres de lISO). Llaboration des Normes internationales est en gnral confie aux comits techniques de lISO. Chaque comit membre intress par une tude a le droit de faire partie du comit technique cr cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non
12、 gouvernementales, en liaison avec lISO participent galement aux travaux. LISO collabore troitement avec la Commission lectrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation lectrotechnique. Les Normes internationales sont rdiges conformment aux rgles donnes dans les Directives ISO
13、/CEI, Partie 2. La tche principale des comits techniques est dlaborer les Normes internationales. Les projets de Normes internationales adopts par les comits techniques sont soumis aux comits membres pour vote. Leur publication comme Normes internationales requiert lapprobation de 75 % au moins des
14、comits membres votants. Lattention est appele sur le fait que certains des lments du prsent document peuvent faire lobjet de droits de proprit intellectuelle ou de droits analogues. LISO ne saurait tre tenue pour responsable de ne pas avoir identifi de tels droits de proprit et averti de leur existe
15、nce. LISO 15788-2 a t labore par le comit technique ISO/TC 34, Produit alimentaires, sous-comit SC 11, Corps gras dorigines animale et vgtale. LISO 15788 comprend les parties suivantes, prsentes sous le titre gnral Corps gras dorigines animale et vgtale Dosage des stigmastadines dans les huiles vgta
16、les: Partie 1: Mthode par chromatographie en phase gazeuse sur colonne capillaire (Mthode de rfrence) Partie 2: Mthode par chromatographie liquide haute performance (CLHP) NORME INTERNATIONALE ISO 15788-2:2003(F) ISO 2003 Tous droits rservs 1Corps gras dorigines animale et vgtale Dosage des stigmast
17、adines dans les huiles vgtales Partie 2: Mthode par chromatographie liquide haute performance (CLHP) 1 Domaine dapplication La prsente partie de lISO 15788 spcifie une mthode pour le dosage des stradines et plus prcisment des stigmastadines. Les stradines se forment par suite de la dshydratation des
18、 strols pendant la dcoloration mais galement, et de faon partielle, pendant lentranement la vapeur et la dsodorisation. La mthode est galement adapte, en tant que mthode de slection, pour dtecter la prsence dhuiles vgtales raffines dans les huiles vierges telles que lhuile dolive vierge. NOTE LISO 1
19、5788-1 constitue la mthode de rfrence pour le dosage des stigmastadines dans les huiles vgtales, tandis que la prsente partie de lISO 15788 peut tre utilise en tant que mthode de slection rapide. En rfrence la fidlit de la prsente mthode (voir Annexe A), des chantillons dhuile dolive vierge proches
20、de la valeur limite adopte par les rglements internationaux Conseil olicole international (COI), CE peuvent tre contrls par la mthode par chromatographie en phase gazeuse donne dans lISO 15788-1. 2 Rfrences normatives Les documents de rfrence suivants sont indispensables pour lapplication du prsent
21、document. Pour les rfrences dates, seule ldition cite sapplique. Pour les rfrences non dates, la dernire dition du document de rfrence sapplique (y compris les ventuels amendements). ISO 3696:1987, Eau pour laboratoire usage analytique Spcification et mthodes dessai ISO 12228, Corps gras dorigines a
22、nimale et vgtale Dtermination de la teneur en strols individuels et totaux Mthode par chromatographie en phase gazeuse 3 Termes et dfinitions Pour les besoins du prsent document, les termes et dfinitions suivants sappliquent. 3.1 teneur en stigmastadines partie des stigmastadines spars par chromatog
23、raphie en phase liquide dans les conditions spcifies par la prsente mthode NOTE Elle est exprime en milligrammes par kilogramme. 3.2 teneur en stradines partie de tous les stradines spars par chromatographie en phase liquide dans les conditions spcifies par la prsente mthode NOTE Elle est exprime en
24、 milligrammes par kilogramme. ISO 15788-2:2003(F) 2 ISO 2003 Tous droits rservs4 Principe Sparation des stradines, sous forme de composs lipidiques non polaires, de la majeure partie des autres lipides, laide dther de ptrole sur une colonne remplie de gel de silice. Concentration de lluat dther de p
25、trole et analyse par chromatographie liquide haute performance sur silice greffe C 18 et dtection UV 235 nm. La quantification dpend du type dchantillon et est effectue avec un talon interne ou externe. 5 Ractifs AVERTISSEMENT Lattention est attire sur la rglementation relative la manipulation des s
26、ubstances dangereuses. Des mesures simposent en matire de technique, dorganisation et de scurit des personnes. Sauf indication contraire, utiliser uniquement des ractifs de qualit analytique reconnue. 5.1 Eau, conforme la qualit au moins 1 de lISO 3696:1987. 5.2 Gel de silice 60, pour chromatographi
27、e sur colonne, de granulomtrie 0,063 mm 0,200 mm, ou 0,063 mm 0,100 mm 1) , et de teneur en eau gale 2 g pour 100 g. Scher le gel de silice dans une coupelle en porcelaine pendant 12 h dans une tuve 160 C, puis refroidir temprature ambiante dans un dessiccateur. Pour obtenir un gel de silice avec un
28、e teneur en eau de 2 g pour 100 g, peser, 1 g prs, 98 g de gel de silice sch dans une fiole conique bouchon en verre rod et ajouter 2 g deau (pes 0,01 g prs). Agiter vigoureusement pendant 1 min et laisser le gel de silice reposer une nuit entire dans un rcipient tanche. 5.3 ther de ptrole, ayant un
29、 point dbullition compris entre 40 C et 60 C. 5.4 Actonitrile, de qualit pour chromatographie. 5.5 tert-Butyle mthyle oxyde, de qualit pour chromatographie. 5.6 Isooctane (trimthyl-2,2,4 pentane). 5.7 Cholesta-3,5-dine 2) , de puret connue au moins gale 95 g pour 100 g. Vrifier la puret de ltalon de
30、 cholestadine par chromatographie en phase gazeuse en utilisant comme talon interne du 5-cholestane. Pour cet essai, voir les conditions de la mthode chromatographique en phase gazeuse pour le dosage des strols spcifie dans lISO 12228. Le facteur de rponse du dtecteur ionisation de flamme est suppos
31、 gal 1,0. Tenir compte de la teneur obtenue lors du dosage des stradines. 5.8 Solutions mres et solutions talons 5.8.1 Solution mre de cholesta-3,5-dine, ayant une concentration de 1 mg/ml. Peser, 0,1 mg prs, 50,0 mg de cholesta-3,5-dine dans une fiole jauge de 50 ml. Mettre en solution et complter
32、au trait repre avec du tert-butyle mthyle oxyde (5.5). 1) Par exemple, n 7734 ou 15101 distribu par E. Merck, 64271 Darmstadt, Allemagne. 2) Par exemple, n C 6012 distribu par Sigma Chemie GmbH, Grnwalder Weg 30, 82041 Deisenhofen, Allemagne. Cette information est donne lintention des utilisateurs d
33、e la prsente partie de lISO 15788 et ne signifie nullement que lISO approuve ou recommande lemploi exclusif des produits ainsi dsigns. ISO 15788-2:2003(F) ISO 2003 Tous droits rservs 35.8.2 Solution talon de cholesta-3,5-dine pour CLHP 5.8.2.1 Solution talon externe, ayant une concentration de 10 g/
34、ml. Verser la pipette 100 l de la solution mre de cholesta-3,5-dine (5.8.1) dans une fiole jauge de 10 ml et complter au trait repre avec un mlange de tert-butyle mthyle oxyde et dactonitrile (5.8.4). Une portion aliquote de 20 l de cette solution contient 0,20 g et est injecte dans la colonne CLHP.
35、 La concentration de la solution talon dpend de la nature de lhuile analyser. En cas dhuiles vierges dont la teneur en stigmastadines est infrieure 0,5 mg/kg, la concentration de la solution talon externe doit tre de 0,2 g/ml. 5.8.2.2 Solution talon interne, ayant une concentration de 2 g/ml. Verser
36、 la pipette 100 l de la solution mre de cholesta-3,5-dine (5.8.1) dans une fiole jauge de 50 ml et complter au trait repre avec de lther de ptrole (5.3). La concentration de la solution talon dpend de la nature de lhuile analyser. Dans le cas dhuiles vierges dont la teneur en stigmastadines est infr
37、ieure 0,5 mg/kg, la concentration de la solution talon interne doit tre de 0,2 g/ml. 5.8.3 Solution talon de 5 -cholestane pour CPG, ayant une concentration de 1 mg/ml. Peser, 0,1 mg prs, 50,0 mg de 5-cholestane 3)dans une fiole jauge de 50 ml et complter au trait repre avec de lisooctane (5.6). Uti
38、liser cette solution pour dterminer la puret de ltalon de cholesta-3,5-dine (5.8.2) comme suit. Verser la pipette 1 ml de solution talon de 5-cholestane et 1 ml de solution mre de cholesta-3,5-dine (5.8.1) dans une fiole jauge de 10 ml (injection par diviseur) ou dans une fiole jauge de 50 ml (injec
39、tion sur colonne) et complter au trait repre avec de lisooctane. 5.8.4 Mlange de tert-butyle mthyle oxyde et dactonitrile, 50:50 (en volume). 5.8.5 Phase mobile pour CLHP: mlange de tert-butyle mthyle oxyde et dactonitrile, 70:30 (en volume), dgaz. 5.9 Cholestane, de puret connue au moins gale 95 g
40、pour 100 g. 6 Appareillage Matriel courant de laboratoire et, en particulier, ce qui suit. 6.1 Ouate ou laine de verre. La ouate peut tre dgraisse par extraction pendant 8 h avec de lther de ptrole. 6.2 Colonne chromatographique, en verre, de 10 mm de diamtre intrieur et de 150 mm de longueur, avec
41、un rservoir de 25 ml. 6.3 Fioles de forme conique, de 25 ml de capacit. 6.4 Fioles jauges, de 5 ml, 10 ml et 50 ml de capacit. 3) Par exemple, n C 8003 distribu par Sigma Chemie GmbH, Grnwalder Weg 30, 82041 Deisenhofen, Allemagne. Cette information est donne lintention des utilisateurs de la prsent
42、e partie de lISO 15788 et ne signifie nullement que lISO approuve ou recommande lemploi exclusif du produit ainsi dsign. ISO 15788-2:2003(F) 4 ISO 2003 Tous droits rservs6.5 Bchers, de diffrentes tailles. 6.6 Systme de CLHP, constitu dune pompe, dun dispositif dinjection de lchantillon (boucle de 20
43、 l et 100 l), dun dtecteur UV pour mesurages 235 nm et dun systme dintgration. 6.7 Colonne de CLHP, de 250 mm de longueur, de 4,0 mm ou 4,6 mm de diamtre intrieur, avec remplissage en phase inverse de type silice greffe C 18, de 5 m 4)de granulomtrie. 6.8 chantillonneur automatique, de capacit appro
44、prie. 6.9 vaporateur rotatif, avec bain deau. 7 chantillonnage Il est important que le laboratoire reoive un chantillon rellement reprsentatif, nayant pas t endommag ou modifi pendant le transport ou lentreposage. Lchantillonnage ne fait pas partie de la mthode spcifie dans la prsente partie de lISO
45、 15788. Une mthode dchantillonnage recommande est donne dans lISO 5555. 8 Prparation de lchantillon pour essai 8.1 Gnralits Avant lanalyse, et si ncessaire, liminer leau de lchantillon de corps gras, en chauffant brivement 100 C environ 5 g de lchantillon et en centrifugeant. Boucher lextrmit de la
46、colonne chromatographique avec un petit morceau de ouate (6.1). Ajouter dans la colonne 5 g de gel de silice (5.2) sans solvant et tasser en tapotant doucement la colonne sur une planche en bois. 8.2 Mthode avec talon externe Peser, 1 mg prs, environ 500 mg dchantillon dans un petit bcher. Les mettr
47、e en solution dans 2 ml dther de ptrole et verser la solution dans la colonne, le robinet tant ouvert. Rincer le bcher deux reprises avec, chaque fois, 2 ml dther de ptrole. Ds que le solvant atteint le haut du garnissage de la colonne, luer les substances non polaires avec 20 ml dther de ptrole et recueillir lluat dans une fiole de forme conique (6.3). vaporer le solvant jusqu siccit totale sur
