1、A Numroderfrence ISO157881:1999 (F) NORME INTERNATIONALE ISO 157881 Premiredition 19991015 Corpsgrasdoriginesanimaleet vgtaleDosagedesstigmastadines dansleshuilesvgtales Partie1: Mthodeparchromatographieenphase gazeusesurcolonnecapillaire(Mthodede rfrence) AnimalandvegetablefatsandoilsDeterminationo
2、fstigmastadienesin vegetableoils Part1:Methodusingcapillarycolumngaschromatography(Reference method)ISO157881:1999(F) ISO1999 Droitsdereproductionrservs.Saufprescriptiondiffrente,aucunepartiedecettepublicationnepeuttrereproduiteniut ilisesousquelque formequecesoitetparaucunprocd,lectroniqueoumcaniqu
3、e,ycomprislaphotocopieetlesmicrofilms,sanslaccordcr itdelditeur. Organisationinternationaledenormalisation Casepostale56 CH1211Genve20 Suisse Internet isoiso.ch ImprimenSuisse ii Avantpropos LISO(Organisationinternationaledenormalisation)estunefdrationmondialedorganismesnationauxde normalisation(com
4、itsmembresdelISO).LlaborationdesNormesinternationalesestengnralconfieaux comitstechniquesdelISO.Chaquecomitmembreintressparunetudealedroitdefairepartieducomit techniquecrceteffet.Lesorganisationsinternationales,gouvernementalesetnongouvernementales,en liaisonaveclISOparticipentgalementauxtravaux.LIS
5、OcollaboretroitementaveclaCommission lectrotechniqueinternationale(CEI)encequiconcernelanormalisationlectrotechnique. LesNormesinternationalessontrdigesconformmentauxrglesdonnesdanslesDirectivesISO/CEI,Partie3. LesprojetsdeNormesinternationalesadoptsparlescomitstechniquessontsoumisauxcomitsmembrespo
6、ur vote.LeurpublicationcommeNormesinternationalesrequiertlapprobationde75 %aumoinsdescomits membresvotants. LaNormeinternationaleISO 157881atlaboreparlecomittechniqueISO/TC 34, Produitsagricoles alimentaires,souscomitSC11, Corpsgrasdoriginesanimaleetvgtale. LISO15788comprendlespartiessuivantes,prsen
7、tessousletitregnral Corpsgrasdoriginesanimaleet vgtaleDosagedesstigmastadinesdansleshuilesvgtales : Partie1:Mthodeparchromatographieenphasegazeusesurcolonnecapillaire Partie2:Mthodeparchromatographieliquidehauteperformance LannexeAdelaprsentepartiedelISO15788estdonneuniquementtitredinformation.ISO I
8、SO157881:1999(F) iii Introduction Lestraitementsthermiquesquimpliquentlesprocessusderaffinageentranentlaformationdequantits significativesdhydrocarburesdansleshuilesvgtales1.Leplusabondantdeshydrocarburestrouvsdans toutesleshuilesvgtalesraffinesestle3,5stigmastadine,strnedrivdu bsitostrolpardshydrat
9、ation2. Le3,5stigmastadineestformenmmetempsquedepetitesquantitsde2,4isomre,lesdeuxsubstances pouvantseconfondresousunmmepic,biendfinisurlechromatogrammeobtenulorsdelanalysedelafraction hydrocarbonesurunecolonnefaiblepolarit3.Ilestdoncpossibledequantifierlasommedesdeuxisomres paranalysechromatographi
10、queenphasegazeusedelafractionhydrocarbonestrodale24. Alorsquepourlhuiledoliveviergeparexemple,lesprocessushabituelsdeproduction(souspressionoupar centrifugation)nedonnentpasdequantitsmesurablesdestigmastadines(moinsde0,01mg/kg),dansles rsidusdhuiledolivebrute,onentrouveenpetitesconcentrations(entre0
11、,2mg/kget3mg/kg),parsuitedu chauffagehautetempraturesubiparcesrsiduspendantleschage. Lesstigmastadinesseformentpendantleprocessusderaffinage,touslesstadesimpliquantunefortemonte entemprature,telsqueladcolorationouladsodorisation;lepremierstade,dlemploideterreblanchir acide,engnretoutefoisdavantagequ
12、elesecond2.Selonlesconditionsrencontrespendantleprocessusde raffinage,lesconcentrationsenstigmastadinesdeshuilesvgtalesraffinesdisponibledanslecommerceseront comprisesentre1mg/kget120mg/kg.Lvaluationdesstigmastadinespermetdoncnonseulementdidentifierles huilesquiontsubiuntraitementthermique,maisgalem
13、entdedtecterdepetitesquantitsdhuilesvgtales raffinesdansleshuilesvierges. Unemthodededosagedesstigmastadinesainsiquelesrsultatsdunetudeinterlaboratoireseffectuesous lesauspicesduConseilinternationaldelhuiledoliveonttprsentslaCommissionhuiles,corpsgraset drivsdelUnioninternationaledechimiepureetappli
14、que(UICPA).Lateneurenstigmastadinesatadopte commecritredidentificationdeshuilesdoliveviergesetlamthodedanalysepertinenteatadoptecomme mthodenormaliseinternationale.NORMEINTERNATIONALE ISO ISO157881:1999(F) 1 CorpsgrasdoriginesanimaleetvgtaleDosagedes stigmastadinesdansleshuilesvgtales Partie1: Mthod
15、eparchromatographieenphasegazeusesurcolonnecapillaire (Mthodederfrence) 1Domaine dapplication LaprsentepartiedelISO15788spcifieunemthodededosagedesstigmastadinesdansleshuilesvgtales viergescontenantdefaiblesconcentrationsdeceshydrocarbures,etnotammentdanslhuiledolivevierge. Cettemthodeestapplicablet
16、outesleshuilesvgtalesbienquelesmesuragesnesoientfiablesquelorsquela teneurenhydrocarburessesitueentre0,01mg/kget4,0mg/kg.Ellepermetdedtecterlaprsencedhuiles vgtalesraffines(dolive,degrignondolive,detournesol,depalme,etc.)dansleshuilesdolivevierges,dansla mesureoleshuilesraffinesrenfermentdesstigmast
17、adines,alorsqueleshuilesviergesobtenuesparpression froidnenrenfermentpas. 2Principe Isolationdelinsaponifiable.Sparationdelafractionhydrocarbonestrodaleparchromatographiesurcolonne rempliedegeldesiliceetanalysedecelleciparchromatographieenphasegazeusesurcolonnecapillaire. 3Ractifs Nutiliserquedesrac
18、tifsdequalitanalytiquereconnueet,saufindicationcontraire,deleaudistilleou dminraliseoudeleaudepuretquivalente. 3.1 Hexane,oumlangedalcanesdontlepointdbullitionestcomprisentre65Cet70C,distillsurcolonne rectificatrice. Lhexanedoittreredistillpourliminerlesimpurets. 3.2 thanol,96%(fractionvolumique). 3
19、.3Sulfatedesodiumanhydre. 3.4 Hydroxydedepotassiumalcoolique ,concentration50gpar500ml. Ajouter10mldeau50gdhydroxydedepotassium,agiter,puisdiluerlemlange500mlavecdelthanol. Lasolutiondhydroxydedepotassiumalcooliquevireaubrunlorsquonlalaissereposer.Ilconvientdelaprparer extemporanmentchaquejouretdela
20、conserverdansdesflaconsenverresombrebienbouchs.ISO157881:1999(F) ISO 2 3.5 Geldesilice60 1) ,pourchromatographiesurcolonne,70230mesh. Engnralilestpossibledutiliserlegeldesilicedirectementausortirdesonconditionnementsansaucun traitement.Certainslotsdesilicepeuventtoutefoisprsenterunefaibleactivitentr
21、anantunemauvaisesparation chromatographique.Danscecasilestrecommanddetraiterlegeldesilicedelamaniresuivante. Activerlegeldesiliceenlechauffant550Cpendantaumoins4h.Aprschauffage,placerlegeldesilicedans undessiccateurpendantquilrefroidit,puisletransfrerdansunflaconbouch.Ajouter2%deauetagiterjusqu disp
22、aritiondesgrumeauxetcoulementlibredelapoudre. Sileschromatogrammesobtenusavecleslotsdegeldesilicedonnentdespicsquiinterfrentlesunsavecles autres,ilconvientdetraiterlegeldelamanireindiquecidessus.Ilestpossiblegalementdutiliserdugelde siliceextrapur60 1) . 3.6 3,5Cholestadine 2) ,depuret99%(fractionma
23、ssique),solutionmredansdelhexane,concentration 10mgpar50ml. 3.7 3,5Cholestadine ,solutiontalondansdelhexane,concentration1mgpar50ml,obtenuepardilutiondela solutionmre(3.6). NOTE Lorsquellessontmaintenuesunetempratureinfrieure4C,lessolutions(3.6)et(3.7)nesedtriorentpas avantundlaide4moisaumoins. 3.8
24、nNonacosane ,solutiondansdelhexane,concentrationdenviron10mgpar100ml. 3.9 3,5Stigmastadine 3) (24thylcholesta3,5dine),solutiondansdelhexane,concentrationdenviron10mg par100ml. 3.10 Gazvecteur ,pourlachromatographie:hliumouhydrognedepuret99,9990%(fractionmassique). 3.11 Gazauxiliaires ,pourdtecteurio
25、nisationdeflamme:hydrognedepuret99,9990%(fractionmassique) etairpurifi. 4Appareillage Appareillagecourantdelaboratoireet,enparticulier,cequisuit. 4.1 Ballon,de250mldecapacit,utilisableavecunrfrigrantreflux. 4.2 Ampoulesdcanter ,de500mldecapacit. 4.3Ballonsfondrond ,de100mldecapacit. 4.4vaporateurrot
26、atif. 1) ProduitfourniparMerck,rf.7734ousimilaireetrf.7754(pourlegeldesiliceextrapur60).Cetteinformationestdonn e lintentiondesutilisateursdelaprsentepartiedelISO15788etnesignifienullementquelISOapprouveourecommande lemploiexclusifdesproduitsainsidsigns.Desproduitsquivalentspeuventtreutilisssilestdm
27、ontrquilsconduise nt auxmmesrsultats. 2) ProduitfourniparSigma.CetteinformationestdonnelintentiondesutilisateursdelaprsentepartiedelISO15788et ne signifienullementquelISOapprouveourecommandelemploiexclusifduproduitainsidsign.Desproduitsquivalents peuventtreutilisssilestdmontrquilsconduisentauxmmesrs
28、ultats. 3) ProduitfourniparChironA.S.,Heimdal,Norvge.Cetteinformationestdonnelintentiondesutilisateursdelaprsente partiedelISO15788etnesignifienullementquelISOapprouveourecommandelemploiexclusifduproduitainsidsign. Desproduitsquivalentspeuventtreutilisssilestdmontrquilsconduisentauxmmesrsultats.ISO
29、ISO157881:1999(F) 3 4.5 Colonneenverrepourchromatographie ,de1,5cmdediamtreintrieursur50cmdelongueur,avec robinetentflonettamponenfibresdelainedeverreoubiendisqueenverrefrittfaisantofficedefond. Pourprparerlacolonnerempliedegeldesilice,yverserdelhexanesurunehauteurde5cmenviron,puisla remplirparpetit
30、esportionsdunmlangedegeldesilicedansdelhexane(15gpour40ml).Laisserreposeret terminerlaprparationenagitantlgrement.Ajouterdusulfatedesodiumanhydre(3.3)surunehauteurdenviron 0,5cmetluerfinalementavecdelhexaneenexcs. 4.6 Chromatographe,pourchromatographieenphasegazeuse,quipdundtecteurionisationdeflamme
31、, duninjecteurdiviseurouoncolumnetdunfourprogrammable 1Cprs. 4.7 Colonnescapillairesensilicefondue ,pourchromatographieenphasegazeuse,de0,25mmou0,32mm dediamtreintrieursur25mdelongueur,revtuesdunephasedephnylmthylsilicone5%dunepaisseur defilmde0,25m. NOTE Dautrescolonnesdepolaritsimilaireouinfrieure
32、peuventgalementtreutilises. 4.8 Enregistreurintgrateur ,avecpossibilitdemodedintgrationvallevalle. 4.9 Microseringue,aiguillefixe,de5l10ldecapacit,pourchromatographieenphasegazeuse. 4.10Manchonlectriquechauffant ,ou plaquechauffante . 5Mode opratoire 5.1 Prparationdelinsaponifiable 5.1.1 Peser 20g 0
33、,1 gdhuiledansunballonde250 ml(4.1).Ajouter1 mldesolutiontaloninternede 3,5cholestadine(3.7)(contenant20g)et75mldhydroxydedepotassiumalcoolique(3.4).Monterunrfrigrant refluxetchaufferjusqulgrebullitionpendant30min.Enleverleballoncontenantlchantillondelasourcede chaleuretlaisserlasolutionrefroidirlen
34、tement(nepaslaisserrefroidircompltementsouspeinedeprisede lchantillon).Ajouter100mldeauettransvaserlasolutiondansuneampouledcanter(4.2)laidede100ml dhexane.Agiterlemlangevigoureusementpendant30setlelaissersesparer. Siunemulsionseproduitquinedisparatpasrapidement,ajouterdelthanolparpetitesquantits. 5
35、.1.2 Transfrerlaphaseaqueuseinfrieuredansunesecondeampouledcanteretextrairedenouveauavec 100mldhexane.liminerdenouveaulaphaseinfrieureetlavertroisfoislesextraitsdhexane(combinsdans uneautreampouledcanter),avecchaquefois100 mldunmlangethanoleau50 ml/100 ml(fraction volumique)jusqucequonobtienneunpHne
36、utre. 5.1.3 Passerlasolutiondhexanetraverslesulfatedesodiumanhydre(50g),laveravec20mldhexaneetfaire vaporerdansunvaporateurrotatif(4.4)30Csouspressionrduitejusqusiccit. 5.2 Sparationdelafractiondestrnes 5.2.1 Transfrerlersidudanslacolonnedefractionnementlaidededeuxprisesdhexanede1mlchacune; laisserl
37、chantillonscoulerdanslacolonnejusqucequeleniveaudelasolutionatteigneledessusdelacouche desulfatedesodium,puisdmarrerllutionchromatographiqueaveclhexaneundbitdenviron1ml/min.Jeter lapremirefractionde25ml30mldluatetrecueillirles40mlsuivants.Transfrerensuitecettefractiondansun ballonfondrondde100ml(4.3
38、). LapremirefractionrenfermeleshydrocarburessatursFigure1a)etlasecondeleshydrocarburesstrodaux. Lapoursuitedellutiondonnedusqualneetdescompossconnexes.Pourobtenirunebonnesparationentre leshydrocarburessatursetlesstrnes,ilestncessairedoptimiserlevolumedesfractions.Pourcefaire,il convientdajusterlevol
39、umedelapremirefractiondetellesortequlanalysedelaseconde,lespicsreprsentant leshydrocarburessaturssoientpeulevsFigure1c);silespicsnapparaissentpasmaisquelintensitdupic talonestfaible,ilconvientderduirelevolume.IlesttoutefoisinutilederechercherunesparationcomplteentreISO157881:1999(F) ISO 4 lescomposs
40、delapremirefractionetdelasecondefraction,danslamesureoilnyapasrecouvrementdes picsdurantlanalysechromatographiquequandlesconditionsdechromatographieenphasegazeusesontrgles delamanireindiqueen5.3.1. NOTE Ilnestengnralpasncessairedoptimiserlevolumedelasecondefractiondufaitdelabonnesparationentre lesautrescomposs.Nanmoins,laprsencedungrandpicunniveaucorrespondantuntempsdertentioninfrieur denviron1,5minceluideltalonestduela
