1、NORME INTERNATIONALE Iso 10705-I Premire dition 1995-08-01 Qualit de leau - Dtection et dnombrement des bactriophages - Partie 1: Dnombrement des bactriophages ARN F spcifiques Wa ter quality - Detection and enumeration of bacteriophages - Part 1: Enumeration of F-specific RNA bacteriophages Numro d
2、e rfrence ISO 10705-I : 1995(F) ISO 10705-1:1995(F) Avant-propos LISO (Organisation internationale de normalisation) est une fdration mondiale dorganismes nationaux de normalisation (comits membres de IISO). Llaboration des Normes internationales est en gnral confie aux comits techniques de IISO. Ch
3、aque comit membre intress par une tude a le droit de faire partie du comit technique cr cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non gouvernemen- tales, en liaison avec IISO participent galement aux travaux. LISO colla- bore troitement avec la Commission lectrotechnique inte
4、rnationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation lectrotechnique. Les projets de Normes internationales adopts par les comits techniques sont soumis aux comits membres pour vote. Leur publication comme Normes internationales requiert lapprobation de 75 % au moins des co- mits membres votants. La
5、 Norme internationale ISO 10705-l a t labore par le comit techni- que lSO/TC 147, Qualit de /eau, sous-comit SC 4, Mthodes micro- biologiques. LISO 10705 comprend les parties suivantes, prsentes sous le titre g- nral Qualit de leau - Dtection et dnombrement des bactriophages: - Partie 1: Dnombrement
6、 des bactriophages ARN F spcifiques - Partie 2: Dnombrement des coliphages somatiques Lannexe A fait partie intgrante de la prsente partie de IISO 10705. Les annexes B et C sont donnes uniquement titre dinformation. 0 ISO 1995 Droits de reproduction rservs. Sauf prescription diffrente, aucune partie
7、 de cette publi- cation ne peut tre reproduite ni utilise sous quelque forme que ce soit et par aucun pro- cd, lectronique ou mcanique, y compris la photocopie et les microfilms, sans laccord crit de lditeur. Organisation internationale de normalisation Case Postale 56 l CH-l 211 Genve 20 l Suisse I
8、mprim en Suisse ii NORME INTERNATIONALE 0 ISO ISO 10705-1:1995(F) Qualit de leau - Dtection et dnombrement des bactriophages - Partie 1: Dnombrement des bactriophages ARN F spcifiques 1 Domaine dapplication 2 Rfrences normatives La prsente partie de IISO 10705 prescrit une m- thode de dtection et de
9、 dnombrement des bactriophages ARN F spcifiques par incubation de lchantillon avec une souche-hte approprie. La mthode peut tre applique tous les types deaux, de sdiments et de boues, si ncessaire aprs dilu- tion. Dans le cas de faible population, une tape de prconcentration peut tre ncessaire pour
10、laquelle une partie spare sera labore. La mthode peut galement tre applique aux extraits de coquillage. Des essais supplmentaires de confirmation des r- sultats, galement spcifis dans la prsente partie de IISO 10705, peuvent tre ncessaires, suivant le nombre plus ou moins lev des bactriophages ARN F
11、 spcifiques par rapport aux autres organismes prsents. Les normes suivantes contiennent des dispositions qui, par suite de la rfrence qui en est faite, consti- tuent des dispositions valables pour la prsente partie de IISO 10705. Au moment de la publication, les ditions indiques taient en vigueur. T
12、oute norme est sujette rvision et les parties prenantes des ac- cords fonds sur la prsente partie de IISO 10705 sont invites rechercher la possibilit dappliquer les ditions les plus rcentes des normes indiques ci- aprs. Les membres de la CEI et de IISO possdent le registre des Normes internationales
13、 en vigueur un moment donn. ISO 3696: 1987, Eau pour laboratoire usage analyti- que - Spcifica tion et mthodes dessai. La prsence de bactriophages ARN F spcifiques dans un chantillon deau indique en gnral une pol- lution par des eaux uses contamines par des ma- tires fcales dorigine animale ou humai
14、ne. Les caractristiques de leur rsistance dans Ienviron- nement, de leur limination par des procds cou- rants de traitement de leau, ainsi que de leur concentration ou rtention par les coquillages, res- semble celle des virus entriques humains prsents dans leau et dans les aliments, par exemple les
15、entrovirus, le virus de Ihpatite A et les rotavirus. ISO 5667-l : 1980, Qualit de leau - chantillonnage - Partie 1: Guide gnral pour Itablissemen t des programmes dchan tilonnage. ISO 5667-2: 1991, Qualit de leau - chantillonnage - Partie 2: Guide gnral sur les techniques dchantillonnage. ISO 5667-3
16、:1994, Qualit de leau - chantillonnage - Partie 3: Guide gnral pour la conservation et la manipulation des chantillons. ISO 10705-1:1995(F) 0 KO I SO 6887: 1983, Microbiologie - Directives gnrales pour la prparation des dilutions en vue de lexamen microbiologique. ISO 8199: 1988, Qualit de leau - Gu
17、ide gnral pour le dnombrement des micro-organismes sur mi- lieu de culture. 3 Dfinition Pour les besoins de la prsente partie de IISO 10705, la dfinition suivante sapplique. 3.1 bactriophages ARN F spcifiques: Virus bactriens capables dinfecter une souche-hte pos- sdant des pili sexuels ou F produis
18、ant des plages vi- sibles de lyse bactrienne sur un tapis de bactries confluentes dveloppes dans des conditions appro- pries, alors que le processus infectieux est inhib en prsence dune concentration de 40 (parfois 400) pg/ml de RNase dans le milieu ensemenc. 4 Principe Mlanger un chantillon avec un
19、 faible volume de milieu de culture nutritif semi-solide. Y ajouter une culture de souche-hte et lensemencer sur un milieu nutritif solide. Incuber puis examiner les botes pour y reprer lapparition de plaques. Si ncessaire, ef- fectuer un examen simultan de botes prpares en parallle avec ajout de RN
20、ase pour confirmer les r- sultats par comptages diffrentiels. Exprimer les r- sultats en concentration en nombre de particules formant des plages (Cptp) par unit de volume. 5 Prcautions relatives la scurit La souche-hte utilise est une souche mute de Salmonella typhimurium faiblement pathogne, quil
21、convient de manipuler conformment aux procdures (nationales ou internationales) de s- curit mises au point pour cette espce bactrienne. Les bactriophages ARN F spcifi- ques ne sont pas pathognes pour lhomme ou lanimal, mais ils sont trs rsistants au schage. II est donc recommand de prendre des prcau
22、- tions appropries pour empcher des contami- nations croises des matriaux dessai, et plus particulirement lors des oprations de manipu- lation et dexamen des cultures bactriennes forte concentration ou lors de lensemencement des cultures de souches-htes. Ces oprations doivent tre effectues dans une
23、enceinte pour risque biologique ou dans une zone spare du laboratoire. 6 Diluant, milieux de culture et ractifs 6.1 Matriaux de base Pour la prparation des milieux de culture et des r- actifs, utiliser des ingrdients de qualit uniforme et des ractifs de qualit analytique, et suivre les ins- truction
24、s donnes dans lannexe A. En ce qui concerne la conservation, se reporter IISO 8199, sauf si prcis dans la prsente partie de IISO 10705. Des milieux complets dshydrats peuvent galement tre utiliss. Dans ce cas, suivre la lettre les instructions du fabricant. Pour la prparation des milieux de culture,
25、 utiliser de leau distille dans des rcipients en verre ou dionise, exempte de substances pouvant inhiber la croissance des bactries dans les conditions de Ies- sai, et conforme IISO 3696. 6.2 Diluant Pour diluer lchantillon, utiliser saline comme indiqu en A.8. une solution peptone 6.3 Ractifs 6.3.1
26、 RNase pancratique bovine, activit spcifi- que approximative de 50 units/mg (Kunitz). 6.32 Disques antibiotiques, pour examiner la sen- sibilit lacide nalidixique (130 pg; 9 mm) et la kanamycine (100 pg; 9 mm). 6.3.3 Glycrol, 870 g/litre. 6.4 Cultures microbiologiques de rfrence Souche de Salmonella
27、 typhimurium WG49, de type phage 3 Nal (F 42 /ac:Tn5), NCTC 12484. Bactriophage MS2, NCTC 12487 ou ATCC 15597-Bl. Escherichia coli K-12 Hfr provenant dune collection de cultures appropries, par exemple NCTC 12486 ou ATCC 23631. NOTE 1 Les souches NCTC sont disponibles la National Collection of Type
28、Cultures, 61 Colindale Avenue, London NW9 6HT, Angleterre. Les souches ATCC sont disponibles IAmerican Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, U.S.A. . 0 ISO ISO 107051:1995( F) 7 Appareillage et verrerie Matriel courant de laboratoire pour analyses micro- biologiques, et
29、 7.1 tuve air chaud pour strilisation en cha- leur sche et autoclave. Exception faite des appa- reillages fournis dj striliss, la verrerie et autre matriel doivent tre striliss suivant les instructions donnes dans IISO 8199. 7.2 Incubateur ou bain deau, contrl thermosta- tiquement 37 “C 7OT (9.1.1)
30、1 Culture en phase exponentielle h partir de colonies lactose positif, ajouter 20 % WV) de glycWo1 1 t CDNTRDLE QUALITE (9.3 C%;:;!;?;C Culture en phase exponentielle CULTUREDELINOCULUM Conserver sur glace fondante, utiliser dans les 2 h (10.1) Figure 2 - Schma de la mise en culture, du maintien et
31、du contrle qualit de la souche-hte WG49 9.1.2 Prparation des cultures dessai Laisser dcongeler le contenu dune fiole de la culture mre (9.1 .l) temprature ambiante et lensemencer dans une bote contenant une glose de McConkey (A.7), ou tout autre milieu contenant du lactose de faon obtenir des coloni
32、es isoles. Incuber 37 “C + 1 “C pendant 18 h + 2 h. Ajouter 50 ml de milieu jA.1) une fiole conique de 300 ml (7.16) et rchauffer temprature ambiante. Choisir trois cinq colonies lactose positif partir de la glose de McConkey et ensemencer chacune de ces colonies dans la fiole contenant le milieu (A
33、.l). Incuber 37 “C + 1 “C pendant 5 h rt: 1 h tout en agitant 100 min- + 10 min-. Ajouter 10 ml de glycrol (A.6) et minger soigneusement. Rpartir dans les fioles en plastique (7.19) par portions aliquotes de 1,2 ml et conserver - 70 “C + 10 “C pendant 2 ans - maximum. Contrler la qualit des cultures
34、 de travail conformment 9.3. NOTES 3 Si lon sattend un grand nombre dessais, plusieurs fioles coniques peuvent tre ensemences en parallle. 4 Si le contrle qualit choue, prparer de nouveaux ino- cula partir de la culture mre. Si le contrle qualit choue plusieurs fois ou si la culture mre est puise, s
35、e procurer une nouvelle ampoule lyophilise de la culture de rfrence. Ne pas procder des repiquages successifs dans le labo- ratoire. 9.2 talonnage des mesures de turbidit Sortir du conglateur une fiole contenant la culture dessai de la souche-hte WG49 et la laisser d- congeler temprature ambiante. A
36、jouter 50 ml de milieu (A.l) une fiole conique nphlomtrique (7.17) et rchauffer temprature ambiante. Ajuster le spectromtre 0 avec le tube latral rempli. On peut galement utiliser des fioles coniques ordinaires (7.16) et ajuster le spectromtre 0 aprs transva- sement du bouillon dans la cuve optique
37、(7.17). En- semencer 0,5 ml de la culture dessai. Incuber 37 “C + 1 “C tout en 100 min- 1 agitant + 10 min- pendant 3 h. Mesurer la turbidit toutes 6s 30 min et prlever un chantillon de 1 ml pour le dnombrement des bactries revivifiables, en ayant soin de rduire au maximum le temps o la fiole est ho
38、rs de lincubateur. ISO 10705=1:1995(F) 0 ISO Diluer les chantillons 10m6 et rpartir des volumes de 0,l ml des dilutions 1 O- 4, 1 O- 5 et 1 O- 6 dans les botes contenant le milieu (A.2) en double; incuber 37 “C le comptage de la bote sur milieu (A.2) (voir 9.2 3 h est de 7 40 x 107 pfc/ml; la propor
39、tion de colonies lactose ngatif (sgrga tion des plasmides) est 80 %. 10 Mode opratoire 10.1 Mode opratoire normalis Sortir du conglateur une fiole de la culture de travail et la dcongeler temprature ambiante. Ajouter 50 ml de milieu (A.l) dans une fiole conique nphlomtrique (7.17) ou dans une fiole
40、conique simple (7.16). Ajuster le spectromtre 0 comme dcrit en 9.2 et prchauffer temprature ambiante. Ensemencer 0,5 ml de la culture dessai. Incuber 37 “C + 1 “C tout en - agitant 100 min- + 10 min-. Mesurer la turbidit toutes les 30 min. Aune turbidit correspondant une densit cellulaire denviron l
41、O* ufc/ml (sur la base des donnes obte- nues en 9.21, sortir de lincubateur la culture de Iinoculum et refroidir rapidement sur de la glace fon- dante. Utiliser ce milieu dans les 2 h. NOTE 7 II est essentiel de refroidir rapidement la culture pour empcher la perte de pili F par les cellules, ce qui
42、 aurait une influence nfaste sur le rendement. Faire fondre les flacons de milieu (A.3), refroidir entre 44 “C et 50 “C, ajouter, dans des conditions daseptie, une solution calcium-glucose (0,5 ml/50 ml) (voir A.l) et rpartir en portions aliquotes de 2,5 ml dans des tubes de culture avec bouchons, placs dans un bain deau 45 “C & 1 “C. Ajouter, chaque tube, 1 ml
