1、NORME INTERNATIONALE ISO 106334 Premire dition 1995-l l-1 5 Tourteaux de graines olagineuses - Dosage des glucosinolates Partie 1: Mthode par chromatograph liquide haute performance e en phase wseea reslaues - ue termIna tlon ot glucosmola tes content - Part 1: Method using high-penormance liquid ch
2、romatography Numro de rfrence ISO 10633-I : 1995(F) ISO 106334:1995(F) Avant-propos LIS0 (Organisation internationale de normalisation) est une fdration mondiale dorganismes nationaux de normalisation (comits membres de IISO). Llaboration des Normes internationales est en gnral confie aux comits tec
3、hniques de IISO. Chaque comit membre intress par une tude a le droit de faire partie du comit technique cr cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non gouverne- mentales, en liaison avec IISO participent galement aux travaux. LISO collabore troitement avec la Commission lec
4、trotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation lectrotechnique. Les projets de Normes internationales adopts par les comits techniques sont soumis aux comits membres pour vote. Leur publication comme Normes internationales requiert lapprobation de 75 % au moins des co- mits me
5、mbres votants. La Norme internationale ISO 10633-I a t labore par le comit technique ISOnC 34, Produits agricoles alimentaires, sous-comit SC 2, Graines et fruits olagineux. LISO 10633 comprend les parties suivantes, prsentes sous le titre gnral Tourteaux de graines olagineuses - Dosage des glucosin
6、olates: - Partie 1: Mthode par chromatographie en phase liquide haute performance - Partie 2: Mthode par spectromtrie de fluorescence aux rayons X Lannexe A fait partie intgrante de la prsente partie de IISO 10633. Lannexe B est donne uniquement titre dinformation. 0 ISO 1995 Droits de reproduction
7、rservs. Sauf prescription diffrente, aucune partie de cette publi- cation ne peut tre reproduite ni utilise sous quelque forme que ce soit et par aucun procd, lectronique ou mcanique, y compris la photocopie et les microfilms, sans laccord crit de lditeur. Organisation Case postale internationale de
8、 normalisation 56. CH-121 1 Genve 20 l Suisse Imprim en Suisse NORME INTERNATIONALE ISO ISO 10633-1:1995(F) Tourteaux de graines olagineuses - Dosage des glucosinolates - Partie 1: Mthode par chromatographie en phase liquide haute performance 1 Domaine dapplication La prsente partie de IISO 10633 pr
9、escrit une mthode pour le dosage par chromatographie en phase liquide haute performance (CLHP) des diff- rents glucosinolates dans les tourteaux de graines de crucifres. NOTES 1 Cette mthode ne dose pas les glucosinolates ayant des substituants sur la partie glucose, mais ces composs sont peu import
10、ants dans les tourteaux de graines olagineuses commercialises. 2 Cette mthode permet de doser les glucosinolates non dgrads. Elle ne permet toutefois pas de rendre compte de la nature et de la quantit des produits issus de la dgradation des glucosinolates durant la prparation des tourteaux. Les effe
11、ts antinutritionnels de ces produits de dgradation ne peuvent pas de ce fait tre pris en consid- ration. 2 Rfrences normatives Les normes suivantes contiennent des dispositions qui, par suite de la rfrence qui en est faite, consti- tuent des dispositions valables pour la prsente partie de IISO 10633
12、. Au moment de la publication, les ditions indiques taient en vigueur. Toute norme est sujette rvision et les parties prenantes des accords fonds sur la prsente partie de IISO 10633 sont invites rechercher la possibilit dappliquer les ditions les plus rcentes des normes indiques ci- aprs. Les membre
13、s de la CEI et de IISO possdent le registre des Normes internationales en vigueur un moment donn. ISO 771 :1977, Tourteaux de graines olagineuses - Dtermination de la teneur en eau et en matires volatiles. ISO 3696: 1987, Eau pour laboratoire usage analy- tique - Spcifica tion et mthodes dessai. ISO
14、 5502:1992, Tourteaux de graines olagineuses - Prparation des chantillons pour essai. ISO 9167-I : 1992, Graines de colza - Dosage des glucosinola tes - Partie 1: Mthode par chromato- graphie liquide haute performance. 3 Principe Extraction des glucosinolates par le mthanol, puis purification et dsu
15、lfatation enzymatique sur rsine changeuse dions. Dtermination par chromatogra- phie en phase liquide haute performance en phase inverse avec gradient dlution et dtection aux ultraviolets. 4 Ractifs Sauf indication diffrente, utiliser uniquement des ractifs de qualit analytique reconnue, et de leau d
16、e qualit 2, conformment IISO 3696. 4.1 Mthanol, de qualit CLHP, solution 70 % (WV). 4.2 Actate de sodium, solution 0,02 mol/1 pH 4,0. 4.3 Actate de sodium, solution 0,2 mol/l. ISO 10633=1:1995(F) 4.4 Formiate dimidazole, solution 6 mol/l. Dissoudre 204 g dimidazole dans 113 ml dacide for- mique dans
17、 une fiole jauge de 500 ml. Ajuster au trait repre avec de leau. 4.5 talon interne Utiliser soit la sinigrine monohydrate (allylglucosino- late de potassium monohydrat, Mr = 415,49) (voir A.l) soit, pour le colza dans lequel la sinigrine est prsente naturellement, la glucotropaoline (benzylglucosino
18、late de potassium monohydrat, M, = 447,52) (voir A.2). Voir lannexe A pour tous les dtails relatifs la prpa- ration et la vrification de la puret de ces ractifs. 4.6 Phases mobiles 4.6.1 luant A: eau purifie par passage sur cartouche de charbon actif) et passe au travers dun filtre de 0,45 prn ou ea
19、u de puret quivalente. 4.6.2 luant B: actonitrile, de qualit CLHP, solu- tion 20 % (WV) dans leau qui a t purifie et pas- se au travers dun filtre de 0,45 prn. La concentration peut tre modifie en fonction de la colonne utilise. 4.7 Rsine changeuse dions 4.7.1 DEAE Sepharose CL-6B*), vendue en suspe
20、n- sion prte lemploi, ou produit quivalent. 4.7.2 Suspension de DEAE Sephadex A25*) Mlanger 10 g de rsine DEAE Sephadex A25 (ou dune rsine quivalente) dans un excs dacide ac- tique 2 mol/l. Laisser dcanter. Ajouter de lacide actique 2 mol/1 jusqu ce que le volume du surna- geant soit gal au volume d
21、u gel dcant. 4.8 Sulfatase, type HI (EC 3.1.6.1)3) dHe/;x pomatia. Purifier, tester et diluer la sulfatase conformment aux mthodes dcrites en A.3.1 A.3.4. ISO 5.2 Colonne de chromatographie pour CLHP, de type Cl8 ou C 250 mm x 5 mm); colonne Novapak Cl colonne Lichrospher RP8, 5 prn (125 mm x 4 mm);
22、 colonne Nucleosil Cl et - dans le tube B, 200 1 de solution dtalon interne 20 mmol/l (A.l.2). NOTE 4 Voir 4.5 pour lutilisation de lune ou lautre des solutions dtalon interne. 8.2.2 Poursuivre le chauffage 75 “C pendant 10 min, en agitant rgulirement. Mlanger le contenu de chaque tube et centrifuge
23、r avec une acc- lration de 5 000 g pendant 3 min. Transvaser le liquide surnageant de chaque tube, dans deux autres tubes (5.6) tiquets A et B. 8.2.3 Ajouter, dans chacun des deux tubes A et B contenant le rsidu, 2 ml dune solution bouillante de mthanol (4.1) et chauffer nouveau pendant 10 min, dans
24、 le bain deau ou le bloc de chauffage (5.7) rgl 75 OC, en agitant les tubes rgulirement. Centrifuger pendant 3 min et ajouter le liquide sur- nageant des tubes A et B respectivement aux liquides surnageants des tubes A et B retenus en 8.2.2. 8.2.4 Ajuster le volume des extraits combins dans les tube
25、s A et B environ 5 ml avec de leau et mlanger. Ces extraits peuvent tre conservs 2 semaines labri de la lumire, au conglateur - 18 OC. 8.3 Prparation des colonnes changeuses dions Couper le nombre de pipettes Pasteur (5.9) appropri, 6) ISO 5500: 1986, Tourteaux de graines olagineuses - chantillonnag
26、e. 3 ISO 10633-1:1995(F) ISO soit deux pipettes par chantillon, de manire laisser un volume de Il2 ml au-dessus de ltranglement et placer un tampon de laine de verre (5.8) au niveau de ltranglement. Placer les pipettes en position verti- cale sur un support. Dposer OI5 ml de la suspension, pralablem
27、ent bien mlange, de rsine changeuse dions (4.7.2) dans chaque pipette, laisser dcanter et couler. Rincer les pipettes avec 2 ml de formiate dimidazole (4.4) puis avec deux fois 1 ml deau. 8.4 Purification et dsulfatation 8.4.1 Effectuer les oprations suivantes pour chaque extrait combin. 8.4.2 Dpose
28、r 1 ml dextrait (8.2.4) sur la colonne prpare (8.3) sans modifier la surface du gel et le laisser scouler. Ajouter deux fois 1 ml de tampon dactate de sodium (4.2) en le laissar chaque fois. 8.4.3 Ajouter dans la colonne 75 FI de sulfatase purifie dilue (4.8). Laisser une nuit temprature ambiante. t
29、 scouler a solution de agir pendant 8.4.4 Placer un tube (5.6) sous la colonne pour recueillir Iluat. luer les dsulfoglucosinolates obtenus avec deux fois 1 ml deau, en laissant leau scouler aprs chaque addition. 8.4.5 Bien homogniser Iluat. Sil nest pas utilis immdiatement pour la chromatographie,
30、il peut tre conserv labri de la lumire au conglateur - 18 OC, pendant une semaine. 8.5 Essai blanc Si ncessaire (voir 9.3), effectuer un essai blanc en suivant le mme mode opratoire, sur une prise des- sai provenant du mme chantillon pour essai, mais en omettant la solution dtalon interne de sinigri
31、ne afin de dtecter et de quantifier une ventuelle pr- sence de sinigrine dans la prise dessai. 8.6 Chromatographie 8.6.1 Rglage de lappareil Rgler le chromatographe (5.1) comme suit: - dbit de la phase mobile (4.6): en gnral de lordre de 1 mI/min selon la nature de la colonne (voir 8.6.2); - temprat
32、ure de la colonne (5.2): 30 OC; - longueur donde de dtection: 229 nm. 8.6.2 Dtermination Selon les instructions relatives lappareillage, injec- ter dans le chomatographe un volume infrieur 50 1 de la solution de dsulfoglucosinolates obtenue en 8.4.4. Utiliser un gradient dlution appropri corresponda
33、nt la colonne utilise. NOTES 5 Les gradients dlution suivants sont indiqus comme exemples. a) Pour une colonne Lichrosorb RP18, 6 5 prn (150 mm x 4,6 mm): - passer 100 % dluant A (4.6.1) pendant 1 min; - appliquer un gradient dlution linaire pendant 20 min jusqu obtention de 0 % dluant A et 100 % dl
34、uant B (4.6.2); - appliquer un gradient dlution linaire pendant 5 min jusqu obtention de 100 % dluant A et 0 % dluant B; - passer 100 % dluant A pendant 5 min pour quilibrer. b) Pour une colonne Lichrospher RP8, 6 5 prn (125 mm x4 mm): - passer 100 % dluant A pendant 2 min 30 s; - appliquer un gradi
35、ent dlution linaire pendant 18 min jusqu obtention de 0 % dluant A et 100 % dluant B; - passer 100 % de Iluant B pendant 5 min; - appliquer un gradient dlution linaire pendant 2 min jusqu obtention de 100 % dluant A et 0 % dluant B; - continuer pendant 5 min pour quilibrer. 6 Les profils des gradien
36、ts peuvent tre modifis pour donner des sparations optimales en fonction des colonnes utilises. 8.6.3 Examen des chromatogrammes Prendre uniquement en compte les pics dont laire est suprieure 1 % de la somme totale des aires des pics . Lordre dlution des pics avec une colonne du type Cl8 et un gradient dlution appropri (voir les exemples donns en 8.6.2) est, en gnral, tel que reprsent la figure 1. 9 Expression des rsultats 9.1 Calcul de la teneur en chaque glucosinolate La teneur en chaque glucosinolate, exprime en micromoles par gramme de matire sche du produit, 4
