1、 ICS:65.020.30 DB51B 40 备案号： 25358 2009 四川省地方标准DB51/T956 2009饲料中牛羊源性成分的检测 -Real-time PCR 法 Detection of bovine and sheep/goat materials in animal feedstuffs using Real-time PCR assay 2009-06-02 发布 2009-06-10 实施四川省质量技术监督局 发布DB51/ T9562009 I 目 次 前言 . II 1 范围 1 2 规范性引用文件 1 3 定义、术语和缩略语 1 4 原理 2 5 试剂和材料
2、2 6 仪器和设备 2 7 取样 3 8 操作步骤 3 9 结果分析和表述 4 DB51/ T9562009 II 前 言 本标准是在查阅大量国内外文献和进行大量实验的基础上，结合我国技术发展水平制定的。 本标准由农业部畜牧司提出。 本标准由全国饲料工业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：农业部饲料质量监督检验测试中心（成都）、成都百乐科技公司。 本标准主要起草人：李云、赵云。 DB51/ T9562009 1 饲料中牛羊源性成分的检测 -Real-time PCR 法 1 范围 本标准规定了饲料中牛羊源性成分检测的抽样、制样、Real-time PCR检测方法和结果判定方法。 本标准适用
3、于饲料中牛羊源性成分的定性检测。 本标准方法检测灵敏度下限为1fg牛或羊DNA。 2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB/T 14699.1-1993 饲料采样方法 GB/T 6682-1992 分析实验室用水规格和试验方法 3 定义、术语和缩略语 下列定义、术语和缩略语适用于本标准 3.1 实时荧光定量 PCR（Real-time PCR ） 在常规PC
4、R反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时检测整个PCR进程，对未知DNA模板进行定性检测，或对初始量进行定量分析。 3.2 阈值循环（Threshold Cycle Ct ） 反应管内的荧光信号强度增长达到背景荧光水平时所对应的PCR循环次数。 3.3 TaqMan 探针（TaqMan probe ） 与DNA扩增区域互补的寡聚核苷酸链，5末端和3末端分别标记荧光报告基团和淬灭基团。 3.4 阈值（Threshold position ） 初始循环荧光信号标准偏差的若干倍值，其背景荧光水平。 3.5 缩略语 Ct：Threshold Cycle，阈值循环 FAM：荧光素，激发光波段495
5、nm，发射光波段为516nm，用于标记牛特异性探针 HEX：荧光素，即放光波段535nm，发射光波段为556nm，用于标记羊特异性探针 EDTA：Ethylene Diaminetetraacetric Acid，乙二胺四乙酸 Tris：Tris-(hydroxymethyl)Aminomethane ，三羟甲基氨基甲烷 SDS：Sodium dodecyl sulfonate， 十二烷基磺酸钠 DB51/ T9562009 2 4 原理 根据牛羊遗传物质的特异性，通过检索基因数据库，选择牛羊特异性的线粒体DNA序列，该序列必须在同类动物中高度保守，而其他动物皆不具 有。利用种属特异性的引物和
6、探针通过PCR扩增这一特定的DNA序列。反应液中的探针会随DNA产物的合成而水解发光，且荧光信号的强度与相应产物DNA的量成正比。通过在整个PCR过程中实时检测荧光信号的增加情况，计算荧光强度是否超过背景水平（即是否有Ct值），以此来判断样品中是否存在牛羊源性成分，并且根据特异性荧光信号判断含有何种反刍动物成分。 5 试剂和材料 除非另有说明，在分析中仅使用分析纯的试剂，水应符合GB/T 6682 一级水要求。 5.1 乙醇 5.2 异丙醇 5.3 Tris（三羟甲基氨基甲烷） 5.4 盐酸 5.5 缓冲液A：100mmol/L Tris-HCl，pH8.0，0.20mmol/L EDTA，5
7、00mmol/L NaCl，1 0SDS。 5.6 缓冲液 B ：乙醚，苯酚，氯仿，异戊醇 V+V+V+V=50+25+24+1 5.7 洗涤缓冲液：70乙醇，3mol/L 醋酸钠。 5.8 DNA 吸附柱 5.9 EDTA（乙二胺四乙酸） 5.10 SDS（十二烷基磺酸钠） 5.11 蛋白酶K 5.12 2Real-time PCR预混反应液（含PCR缓冲液、dNTPs、热启动 Taq DNA聚合酶、Mg2+）。 5.13 牛特异性上游引物 BF： 5-CTACACACCTCCAAACAACGAAG-3。 牛特异性下游引物BR：5-CCAATTCATGTGAGTGTCAGTAGG-3 牛特异
8、性探针BR：FAM-5-ATTCCGACCACTCAGCCAATGCCT-3-BHQ1 5.14 羊特异性上游引物 OF： 5-TTTCGCCTTTCACTTTATTTTCCC-3。 羊特异性下游引物OR：5-GGGTTGTTGGATCCTGTTTCG-3。 羊特异性探针OP：HEX-5-CGCAGCCCTCGCCATAGTTCACCT-3-BHQ1 5.15 引物溶液：用TE 溶液分别将各引物配制成100mol/L 贮备液，-20下保存。 5.16 探针溶液：用TE 溶液分别将各探针配制成100mol/L 贮备液，-20下避光保存 6 仪器和设备 6.1 高速离心机（大于12000r/min
9、）。 6.2 Real-time PCR 检测系统（至少具备490nm、530nm 两个检测通道）。 6.3 涡旋混合器。 6.4 Real-time PCR 反应管（与Real-time PCR 检测系统配套）。 6.5 pH 计 6.6 可调式恒温水浴锅 6.7 高压灭菌锅 6.8 微量移液器及配套吸头（0.11000L） 6.9 超净工作台 6.10 冰箱（-20） 6.11 带盖离心管（0.5mL，1.5mL，2.0mL） DB51/ T9562009 3 6.12 紫外分光光度计 7 取样 按GB/T14699.1选取具有代表性的实验室样品，用四分法缩减分取5 0g 左右，粉碎过0.
10、125mm孔径的筛，充分混匀，装入容器中备用。 8 操作步骤 8.1 DNA 模板的提取 8.1.1 操作方法 称取100mg左右预处理试样，装入2mL已灭菌的离心管中，加入200 L缓冲液A，混合均匀；加入现配蛋白酶K溶液（10mg/mL）40 L，并立即混匀样品；60水浴3h，每1015min上下颠倒离心管以混匀样品；样品中再加入现配蛋白酶K溶液20 L以彻底消解样品，55过夜；70水浴1020min；同时准备10mmol/L Tris-HCl（pH=9.0）或双蒸水于70水浴锅中预热待用；样品中再加入200 L缓冲液B，混匀后70水浴10min；取出样品，加入210 L异丙醇，混匀后离心
11、2min（8000r/min），将上清液移入DNA 吸附柱（吸附柱装入收集管上），弃去沉淀；离心2min（ 8000r/min）,弃去收集管和滤液，将DNA吸附柱装入新收集管中；500 L洗涤缓冲液洗柱2次，离心2min（8000r/min），弃去洗涤液再离心2min（12000r/min） 以彻底去除残留的异丙醇； 将DNA吸附柱装入1.5mL灭菌离心管， 以30 L Tris-HCl（pH=9.0 70预热）洗柱，离心2min（12000r/m in），将DNA洗入离心管中（注意要将缓冲液滴加在膜的中央，同时在室温下放置1-5min后再离心洗脱DNA）。提取的DNA用紫外分光光度计测定浓度
12、后于-20下保存。 可用等效的DNA提取试剂盒或者其他有效方法制备DNA模板。 8.2 Real-time PCR 反应 8.2.1 反应液成分 在Real-time PCR 专用反应管中依次加入反应成分，各成分终浓度如下： 2Real-time PCR预混反应液 1 100mol/L牛特异性上游引物BF 200nmol/L 100mol/L牛特异性下游引物BR 200nmol/L 100mol/L牛特异性探针BP 200nmol/L 100mol/L羊特异性上游引物OF 200nmol/L 100mol/L羊特异性下游引物OR 200nmol/L 100mol/L羊特异性探针OP 200nm
13、ol/L DNA模板 1 L 加双蒸水至25 L。每个样品重复3次。 设置阴性对照、阳性对照以及NTC（No Templa te Control）对照。阴性对照是指不含牛羊源性成分饲料提取的DNA样品作为PCR模板；阳性对照是指牛和羊组织提取DNA作为PCR模板；NTC对照是指用重蒸水作为PCR模板。 反应体系的配制在冰浴条件下进行。加样前应根据总反应管数量将相同的成分加入到一个EP管内，充分混合均匀后短暂离心，分装成需要的反应数量，再加入各样品DNA模板。 准备好的反应管经短暂离心后再放入Real-time PCR仪中。 8.2.2 Real-time PCR 循环程序 热循环程序如下： 9
14、5预变性热启动1min3min（根据不同的热启动 Taq DNA聚合酶热启动要求确定） 40次循环（95变性15s，58退火15s，72 延伸30s并选择FAM-490nm、HEX-530nm下采集荧光信号） 8.2.3 数据分析 DB51/ T9562009 4 Real-time PCR仪实时记录荧光信号，反应结束后自动计算出荧光阈值和样品CT值。 9 结果分析和表述 9.1 结果表述及分析条件设定 实验结果以平均Ct值表述。 9.2 质控标准 9.2.1 阴性对照应无FAM 和HEX 下的Ct 值，或Ct 值大于35。 9.2.2 空白对照应无FAM 和HEC 下的Ct 值，或Ct 值大于35。 9.2.3 阳性对照有FAM 和HEX 下的Ct 值，且Ct 值小于35。 9.3 结果判定 样品无FAM和HEX下的平均Ct值或Ct值大于35，该样品为阴性，不含牛、羊源性成份。 样品有FAM和HEX下的平均Ct值且Ct值小于35，该样品为阳性，同时含有牛、羊源性成份。 样品有FAM下的平均Ct值且Ct值小于35，而无HEX下的平均Ct值，该样品为阳性，含有牛源性成份。 样品有HEX下的平均Ct值且Ct值小于35，而无FAM下的平均Ct值，该样品为阴性，含有羊源性成份。
