1、 ICS 11.220 B 41 DB51 四川省地方标准 DB51/T 14202012 动物细粒棘球蚴检疫技术规范 全血金标免疫渗滤法 2012 - 03 - 30 发布 2012 - 05 - 01 实施四川省质量技术监督局 发布DB51/T 14202012 I 目 次 前 言 . II 1 范围 . . 1 2 规范性引用文件 1 3 术语和定义 1 4 检测方法 . . 2 附录 A（资料 性附录）试剂的配制方法 4 附录 B（资料 性附录）细粒棘球蚴囊液粗抗原制备 5 参考文献 . 6 DB51/T 14202012 II 前 言 本标准由四川出入境检验检疫局提出并归口。 本标准
2、由四川省质量技术监督局批准发布。 本标准起草单位：四川出入境检验检疫局、四川农业大学。 本标准主要起草人：余华、杨光友、严玉宝、胡娟、崔鹏博、周岷江。 DB51/T 14202012 1 动物细粒棘球蚴检疫技术规范 全血金标免疫渗滤法 1 范围 本标准规定了动物细粒棘球蚴的检疫技术方法。 本标准适用于动物细粒棘球蚴的全血金标免疫渗滤法检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 NY/T 541 动物疫病
3、实验室检验采样方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准 3.1 细粒棘球蚴 Echinococcosis granulosa 指细粒棘球绦虫（ Echinococcus granulosus）的中绦期幼虫，它寄生于牛、羊等动物及人的肝脏和肺脏等部位，可引起动物和人的严重寄生虫病，即棘球蚴病（ Hydatidosis）或称包虫病。 3.2 全血金标免疫渗滤法 DIGFA 是一种检测全血标本的棘球蚴现场快速检测方法，它以硝酸纤维素膜为载体，利用微孔滤膜的可滤过性，使抗原抗体反应和洗涤在一特殊的渗滤装置上以液体渗滤过膜的方式迅速完成。全血金标免疫渗滤法方法是采用土豆凝集素与全血混合达到快速凝
4、血的目的。 4 检测方法 4.1 试剂和材料 以下所用的试剂，除特别注明者外均为分析纯试剂；水为符合GB/T 6682规定的二级水。 DB51/T 14202012 2 氯金酸； 抗检测动物 IgG二抗； 三羟甲基氨基甲烷（ Tris）； 塑料小盒； 吸水垫料； 硝酸纤维素膜（NC膜）； 碳酸钾； 土豆凝集素； 5%的BSA封闭液，配制见附录 A.5； PBS缓冲液, 配制见附录 A.6； PBST洗涤液，配制见附录 A.7； 受检动物细粒棘球蚴抗体阳性血清； 受测动物细粒棘球蚴抗体阴性血清； 硫酸铵沉淀法纯化的细粒棘球蚴囊液抗原（ 0.2 mg/mL），配制见附录B。 4.2 仪器和设备 高
5、速冷冻离心机； 移液枪； 核酸蛋白仪； 紫外分光光度计； 金标喷点仪。 4.3 检测步骤 4.3.1 待检血样 按照 NY/T 541“样品的采集”有关章节要求，采集每头待检动物全血 5 mL，加入 0.01%的土豆凝集素（ 50 L） ，室温（ 20 26条件下操作）备用。 4.3.2 胶体金-抗抗体制备 4.3.2.1 试剂配制 0.01%氯金酸溶液配制见 A.1； 1%的柠檬酸三钠溶液配制见 A.2； 0.1 moL/HCL配制见 A.3。 4.3.2.2 制备方法 取 0.01%氯金酸溶液 100 mL加热煮沸后，在剧烈搅拌下加入 1%的柠檬酸三钠溶液 3 mL。待溶液变成葡萄酒红色后
6、继续煮 10 min，冷却后以 0.1 moL/HCL调节 pH至 6.0，将抗抗体按照 1:40的浓度加入胶体金中。迅速混匀 10 min后，加入 1%的 PEG（ MV10000）使其浓度为 0.05%， 3000 r/min离心 5 min，取上清 12000 r/min离心 20 min，弃上清，沉淀混悬于含 1%BSA的 PBS中，即为胶体金抗抗体结合物。 DB51/T 14202012 3 4.3.3 诊断膜制备 硝酸纤维素膜（NC膜）（孔径 0.3 m）用超纯水浸泡 30 min，取出晾干后用铅笔在膜上画出 1cm见方的方格，用 pH7.2的 Tris-HCL缓冲液（配制见附录
7、A.4）浸泡 30 min晾干后，根据需要剪成一定大小，将 1 L制备好的棘球蚴囊液抗原（ 0.2 mg/mL）点于NC膜膜片上方格中央，待室温下干燥后，用含 5%的BSA的封闭液进行封闭， 37 干燥后置 4 冰箱保存。 4.3.4 渗滤装置组装 将处理好的硝酸纤维素膜（NC膜）下垫一层吸水垫料，并压缩于塑料小盒内。 4.3.5 金标免疫渗滤操作 4.3.5.1 将检测装置置于平板上，在 NC 膜中央滴加 5 L 的 PBS 缓冲液（ 0.02 mol/L pH7.4）。 4.3.5.2 待 PBS 缓冲液渗入，加 5 L 待测全血样本。 4.3.5.3 待全血样本渗入，加 10 LPBST
8、 洗涤液（ pH7.4，含 0.05%Tween-20 的 0.01 molPBS）洗液洗去未结合抗体。 4.3.5.4 待 PBS 缓冲液渗入，加胶体金标记抗 IgG 结合物 1 滴。 4.3.5.5 待胶体金标记抗 IgG 结合物渗入，加 10 LPBST 洗涤液（ pH7.4，含 0.05%Tween-20 的 0.01 molPBS）洗去未结合抗抗体。 4.3.5.6 静置，肉眼观察结果。 4.3.6 结果判定 肉眼观察，每次试验时均须设立阳性、阴性血样对照，对照成立方可判定结果。完成上述操作后，室温下（ 20 26条件下操作）静置 10 min后观察结果，直到硝酸纤维素膜（NC膜）抗
9、原点显示出紫红色斑点。根据斑点颜色深浅可以标记为： +深度为强阳性， +深度为阳性， +深度为弱阳性，未出现斑点则为阴性。 DB51/T 14202012 4 A A 附 录 A （资料性附录） 试剂的配制方法 A.1 0.01%氯金酸溶液 将 1g氯金酸溶于 100 mL蒸馏水（氯金酸极易潮解）配成高浓度溶液，取 1 mL高浓度氯金酸溶液混合 99 mL蒸馏水配制成 0.01%氯金酸溶液，置 4保存。 A.2 1%的柠檬酸三钠溶液 1 g柠檬酸三钠，溶于 99 mL蒸馏水，配制成 1%的柠檬酸三钠溶液，置 4保存。 A.3 0.1 moL/HCL 0.1 mol/L的盐酸由 36 37%的浓
10、盐酸 9 mL，注入 1000 mL水摇匀，密闭储存。 A.4 pH7.2的 Tris-HCL缓冲液 Tris（三羟甲基氨基甲烷） 2.4228 g、 800 mL蒸馏水，再也 HCl调节 pH至 7.2，再定容至 1000 mL，置于 4保存。 A.5 5 %的 BSA封闭液（ 100 mL） 取 5 g BSA（牛血清白蛋白），加 PBS缓冲液定容至 100 mL，置于 4 保存。 A.6 PBS（ pH7.4）缓冲液 取 KH2PO42H2O 0.2 g， Na2HPO412H2O 2.9 g， NaCl 8.0 g， KCl 0.2 g，加蒸馏水至 800 mL，调节 pH至 7.4，
11、加蒸馏水定容至 1000 mL，置于 4保存。 A.7 PBST洗涤液 取 0.5 mL Tween-20 加入 1000 mL PBS（ pH7.4），搅拌混匀，置 4保存。 DB51/T 14202012 5 附 录 B （资料性附录） 细粒棘球蚴囊液粗抗原制备 从动物屠宰场采集寄生于动物 （绵羊或牛） 肝脏和肺脏的细粒棘球蚴包囊， 在无菌条件下抽取囊液，除去上层脂类，反复冻融 3次。并在冰浴中用 9.5 mm探头 23 KHZ超声粉碎两次，每次 30 sec。然后将抗原 4000 r/min离心 30 min，取上清液，经硫酸铵盐析，再用 PBS（ pH7.4， 0.02 mol/mL）
12、透析。经核酸蛋白仪测定蛋白浓度为 2.7 mg/mL，冷冻保存。 DB51/T 14202012 6 参 考 文 献 1 Eckert J,Epizootics I O. WHO/OIE manual on echinococcosis in humans and animals: a public health problem of global concern. World Organisation for Animal Health Paris, 2001. 2 郭志宏，彭毛，李永寿，等 . 青海省部分地区人包虫病的流行调查 . 中国动物检疫， 2008， 25（ 5）： 32-33.
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