1、 ICS 65.020.01 B 16 DB51 四川省地方标准 DB51/T 13622011 黄瓜绿斑驳花叶病毒检验鉴定技术方法酶联免疫吸附测定法 2011 - 12 - 28 发布 2012 - 03 - 01 实施四川省质量技术监督局 发布DB51/T 13622011 I 目 次 前 言 . II 1 范围 . . 1 2 规范性引用文件 1 3 原理 . . 1 4 试剂与材料 1 5 仪器及用具 2 6 检测样品 的取样及制备 . . 2 7 实验室检验 3 8 结果判定与记录 3 9 样品保存 . . 3 附录 A（资料性附录） 黄瓜绿斑驳花叶病毒基本信息 4 附录 B（规范性
2、附录） 黄瓜绿斑驳花叶病毒酶联免疫吸附测定法检验程序 5 DB51/T 13622011 II 前 言 本标准附录A为资料性附录、附录B为规范性附录。 本标准由四川省农业厅提出并归口。 本标准由四川省质量技术监督局。 本标准起草单位：四川省农业厅植物检疫站，成都市植物检疫站，绵阳市植保植检站，江油市植保植检站，彭州市植保植检站。 本标准主要起草人：万佳、宁红、谭家兴、谢成伦、蒋辉、李耄、严群、刘如东、刘晓明、徐晖、黄玲、熊玉兰。DB51/T 13622011 1 黄瓜绿斑驳花叶病毒检验鉴定技术 方法酶联免疫吸附测定法 1 范围 本标准规定了黄瓜绿斑驳花叶病毒的检验鉴定方法。 本标准适用于葫芦科
3、作物的黄瓜绿斑驳花叶病毒检验鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 15569-2009 农业植物调运检疫规程 SN/T 2344-2009 黄瓜绿斑驳花叶病毒检疫鉴定方法 3 原理 黄瓜绿斑驳花叶病毒( Cucumber gre en mottle mosaic virus，CGMMV)寄主广泛，危害严重，是 一种通过种子远距离传播的病毒性病害。由于CGMMV的粒体形态、大小等特性很难与同类病毒相区分，症状多样并常有隐症现象。采用酶联免疫吸
4、附测定法，通过CGMMV病毒蛋白抗原决定簇与相应抗体的特异性结合，快速进行黄瓜绿斑驳花叶病毒检验鉴定。 4 试剂与材料 除非另有说明，在本标准中仅使用确认的分析纯试剂和蒸馏水或去离子水或相当纯度的水。 包被抗体（Coating antibody）黄瓜绿斑驳花叶病毒抗体，抗体稀释度按市售产品要求进行。贮藏于 4备用。 酶标抗体（Antibody-enzyme c onjugate）用碱性磷酸酶标记的黄瓜绿斑驳花叶病毒的免疫球蛋白抗体。按市售产品要求进行稀释，贮藏于 4 备用。 包被缓冲液（Coating bu ffer）取 2.93 g 碳酸氢钠（NaHCO 3）、1.59 g 碳酸钠（Na 2
5、CO3），用 1000 mL 蒸馏水溶解，pH 值为 9.6，贮藏于 4备用。 PBST 洗涤液(PBST Buff er)取 1.15 g 无水磷酸氢二钠（Na 2HPO4）、0.2 g 氯化钾（KCl）、0.2 g 无水磷酸二氢钾（KH 2PO4） 、8.0 g 氯化钠（NaCl）、0.5 ml 吐温20 ，用 1000 mL 蒸馏水溶解，pH 值为 7.2。 样品提取缓冲液（General extr action buffer）取 20 g 聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、2.0 g 蛋清蛋白、1.3 g 无水亚硫酸钠（Na 2SO3）、0.2 g 叠氮化钠（NaN 3）、0.5 ml 吐温2
6、0、8 g 氯化钠、0.2 g 磷酸二氢钠、1.15 g 磷酸氢二钠、0.2 g 氯化钾，用 1000 mL 蒸馏水溶解，贮藏于 4备用。 共轭物缓冲液（Conjugate buff er）取 0.2 g 牛血清白蛋白，用 100ml PBST 缓冲液溶解，贮藏于 4备用。 DB51/T 13622011 2 底物（pNPP）对硝基苯磷酸二钠 底物缓冲液（Substrate Buffer）取 0.1 g 氯化镁（MgCl 2）、90.39 g二己醇胺（CH 2CH2OH）、19.82 g 二己醇胺-HCl（CH 2CH2OH-HCl），用 1000ml 蒸馏水溶解，pH 值为 9.8，贮藏于
7、4备用。 终止液 12 g 氢氧化钠（NaOH）溶于 100 mL 蒸馏水。 5 仪器及用具 仪器及用具包括： 聚乙烯微量滴定板（40 孔和 96 孔）。 移液器（2 L10 L、10 L50 L、10 L200 L、200 L1000 L 和 1 mL5 mL）。 天平（1/100 g，1/1000 g）。 培养箱。 台式高速离心机。 酶联免疫检测仪。 研钵（内径 60 mm80 mm）。 剪刀。 冰箱。 超低温冰箱。 6 检测样品的取样及制备 6.1 种子样品 种子样品取样数量按 GB 15569-2009 附录 E的规定进行，制备按 SN/T 2344-2009 4.1的规定进行。 6.
8、2 受害植株及植物产品 在葫芦科作物生长期和结果期出现黄瓜绿斑驳花叶病毒疑似症状， 可整株取样或采集植物产品有症状的部分在冷藏条件下（将样品置于内装冰块、冰袋的保温瓶或泡沫箱中）送检，确保样品新鲜。病害特征参见附录 A。 6.3 无病害特征植株及植物产品 没有症状的葫芦科作物植株及植物产品按五点取样法进行抽样检验。 先确定一个样品取样范围的对角线中点作为中心抽样点，再在对角线上选择四个与中心抽样点距离相等的点作为抽样点。其中，苗期小植株为整株取样；大田高大植株为部分植株取样，剪截植株顶部嫩梢 15cm 部分。抽样数量参照表 1。 表1 黄瓜绿斑驳花叶病毒检测取样数量 类型 种植面积 样品数量3
9、000 15大田 666 1注：每 5 个单株为一个样，不同品种分别计算。 DB51/T 13622011 3 7 实验室检验 黄瓜绿斑驳花叶病毒酶联免疫吸附测定法见附录B。如采用市售的试剂盒，按说明操作。 8 结果判定与记录 在阴性对照 OD 值0.1，且阳性对照 OD 值大于阴性对照 OD 值 2 倍的前提下，样品孔 OD 值大于阴性对照 OD 值 2 倍时，判定为阳性反应，即样品带 CGMMV；否则判定为阴性反应，即样品不带 CGMMV。 酶联免疫测定需记录酶联板反应原始照片及数据。 9 样品保存 经检验鉴定后的样品，应在-20及以下保存三个月。其中，阳性样品保存期满后需进行灭活处理。
10、DB51/T 13622011 4 A A 附 录 A （资料性附录） 黄瓜绿斑驳花叶病毒基本信息 A.1 黄瓜绿斑驳花叶病毒分子生物学特性 黄瓜绿斑驳花叶病毒( Cucumber green mottle mosaic virus，CGMMV)属于烟草花叶病毒属（ Tobamovirus） 。该病毒为正单链线状RNA病毒，病毒粒体长杆状，300nm 18nm，基因组长度约6.5k。该病毒含有5端和3端非翻译区，5端含帽子结构，3端具有一个可接受组氨酸的类似tRNA状的结构。CGMMV编码区共有4个开放阅读框，分别编码129/186kD a，29kDa和17.3kDa共4种蛋白。 A.2 寄主
11、范围及传播途径 该病主要为害葫芦科植物，寄主有黄瓜、西瓜、甜瓜、葫芦、笋瓜、瓠瓜、西葫芦、棱角丝瓜、无花果叶瓜、南瓜等 ， 是一种通过种子远距离传播的病毒性病害。 黄瓜绿斑驳花叶病毒是典型的种传病毒，带毒种子是其远距离传播的主要途径。授粉、嫁接、整枝等农事操作，植株间接触、汁液、花粉、灌溉水、被污染的包装容器，以及被病残体污染的土壤等也能传毒，其中嫁接工具带毒是病毒传播的又一重要途径。 A.3 病害特征 黄瓜：症状表现为叶片斑驳并凸起，畸形，造成植株矮化，果实上可产生黄或银色条斑，果实严重受损，产量可下降 15。 西瓜：受侵染叶片轻型叶斑驳，植株矮化，果实成熟期症状严重，果实表面浓绿色圆斑，内
12、部出现果肉变色和腐烂。 甜瓜：茎端新叶出现黄斑，但随叶片老化症状减轻。 瓠瓜：叶片出现花叶，有绿色突起，脉间黄化，叶脉呈绿带状。 南瓜：绿脉、花叶症状。 葫芦：绿脉、花叶症状。 A.4 分布地区 目前，发生的国家和地区有欧洲的英国、爱尔兰、德国、荷兰、西班牙、丹麦、瑞典、芬兰、罗马尼亚、匈牙利、保加利亚、捷克、波兰、俄罗斯、摩尔多瓦、希腊；南美洲的巴西；亚洲的沙特阿拉伯、伊朗、以色列、巴基斯坦、印度、日本、韩国、朝鲜、中国（安徽省、广东省、辽宁省、湖北省、四川省、海南省以及台湾省）。 DB51/T 13622011 5 B B 附 录 B （规范性附录） 黄瓜绿斑驳花叶病毒酶联免疫吸附测定法检
13、验程序 B.1 包被抗体 B.1.1 包被 用包被缓冲液稀释CGMMV包被抗体，在所需反应孔中加入100 L。将酶联反应板置于保湿容器中，37 孵育4 h。 B.1.2 洗板 向每个反应孔中加入200 L PBST洗涤液，迅速倒出，重复2次。洗板完成后将酶联反应板在纸巾上拍干。 B.2 点样 B.2.1 样品制备 将待测样品剪碎混匀后取其中1 g置于研钵中， 加入10 mL样品提取液充分研磨后， 以一层薄棉布 （或类似细棉纱）过滤样品。在制样时应注意防止样品的交叉污染。 B.2.2 点样 用移液器将制备好的样品按每孔100 L加入酶联反应板孔内，每个样品重复一次，设置阳性对照、阴性对照和包被缓
14、冲液空白对照。加样完成后将酶联反应板置于保湿容器中，4冰箱孵育过夜（至少16小时）。剩余样品于-20冰箱保存备查。 B.2.3 洗板 在每个反应孔加满PBST洗涤液，迅速倒出，重复2次。洗板完成后将酶联反应板在纸巾上拍干。 B.3 结合酶标抗体 B.3.1 加酶标抗体 向酶联反应板每孔加入100 L用共轭物缓冲液按比例稀释的酶标抗体溶液。置于保湿容器中37 孵育1 h。 B.3.2 洗板 同B.2.3，重复4次。 B.4 显色 DB51/T 13622011 6 每孔加入 100 L 底物溶液。 25 避光孵育 1h，至阳性对照显色。 B.5 终止反应 显色后在每孔中加入50 L 终止液。记录检检测结果和酶联板反应原始照片，存档备查。 B.6 结果测定和记录 用酶联检测仪测定在405nm光度下的吸光率（OD值）并记录。 _ DB51/T 13622011
