1、 ICS B 40 DB51 备案号：30902-2011 四川省地方标准 DB51/T 12992011 山羊胚胎移植技术操作规程 Work Regulations of Goats Embryo Transfer 2011 - 06 - 27 发布 2011 - 07 - 01 实施四川省质量技术监督局 发布DB51/T 12992011 I 目 次 前 言 . II 1 范围 1 2 术语和定义 1 3 技术操作规程 1 附录A（资料性附录） 胚胎移植技术所需器械、物品、仪器 6 附录B（资料性附录） 推荐药物剂量及生产厂家、溶液配方及配制 8 DB51/T 12992011 II 前
2、言 本标准附录A、附录B为资料性附录。 本标准由四川省畜牧食品局提出并归口。 本标准由四川省质量技术监督局批准发布。 本标准起草单位：西南民族大学 四川省畜禽繁育改良总站。 本标准起草人：李键 王永 字向东 徐亚欧 傅昌秀。 DB51/T 12992011 1 山羊胚胎移植技术操作规程 1 范围 本规程规定了四川丘区主要山羊品种胚胎移植技术的术语和定义及技术操作规程。 本规程适用于四川主要山羊品种的胚胎生产及舍饲型受体羊的胚胎移植。其他品种山羊可参照执行。 2 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 2.1 供体 Donor 本规程供体指提供胚胎的良种山羊。 2.2 受体 Receptor
3、接受胚胎的本地普通山羊。 3 技术操作规程 3.1 准备工作 3.1.1 工作场地的准备 要有15m2左右的工作室、15 m2左右的无菌手术间和6 m28 m2的无菌操作间,保证水和电源，工作室和无菌间应配备加温设备，使室温保持在2225。供体和受体羊应相对集中，便于观察、实施超数排卵和同期发情。 3.1.2 物品准备 见附录A。 3.2 供体选择及饲养管理 3.2.1 供体选择：必须具备以下条件。 3.2.1.1 生产性能优良、无遗传缺陷。 3.2.1.2 遗传性能稳定、谱系清楚。 3.2.1.3 有健全的传染病、寄生虫病防治措施。 3.2.1.4 体质健康、无生殖器官疾病的经产母羊， 年龄
4、最好控制在 24 周岁， 本繁殖周期内正常产羔。 3.2.1.5 处理前应观察到 2 个以上正常发情周期，或断奶 1 月2 月，并观察到至少 1 次自然发情。 3.2.2 供体的饲养管理 DB51/T 12992011 2 3.2.2.1 保持饲养环境卫生、干燥、温度适宜。 3.2.2.2 制定合理的日粮配方，短期优饲，尤其应加强蛋白质营养，并注意青绿饲料、矿物质和维生素的供应。保持良好的营养状况，体况中上等。 3.2.2.3 满足清洁饮水需要。 3.2.2.4 舍饲羊应保证适当的运动。 3.2.2.5 保持饲养环境相对稳定，避免应激反应。 3.3 配种公羊要求 必须达到供体山羊本品种特、一级
5、要求。 3.4 受体选择与饲养管理： 3.4.1 受体选择：必须具备以下条件。 3.4.1.1 体质健康、无生殖器官疾病，有健全的传染病、寄生虫病防治措施。 3.4.1.2 经产母羊应为本繁殖周期正常产羔，断奶 1 个月以上，同期发情处理前观察到 1 个以上正常发情周期，体重 40kg 以上；青年母羊，年龄应达到 1 周岁以上，体重 40kg 以上，发情周期正常。 3.4.1.3 按照供、受体比例 1:12 的原则，准备侯选受体，经适应性饲养和观察，最终按照 1:10 的比例选定同期发情受体羊。 3.4.2 受体羊饲养管理 3.4.2.1 受体母羊选定后，畜群的饲养管理应和供体畜群同样对待（见
6、 3.2.2.13.2.2.5）。 3.4.2.2 单独组群饲养，胚胎移植前后避免应激。 3.5 超数排卵及胚胎回收 3.5.1 供体超数排卵 3.5.1.1 季节选择 春秋两季，即在4月5月和9月11月。 3.5.1.2 超数排卵激素药物 FSH（垂体促卵泡素） PG（氯前列烯醇） 羊实用型炔诺酮阴道栓 推荐以上药物生产厂见附录。 3.5.1.3 超数排卵激素剂量 推荐使用剂量见附录。 3.5.1.4 超数排卵方法 将初选合格的波尔山羊母羊,用孕激素阴道栓进行预处理。 预处理6d9d后开始采用FSHPG进行超数排卵。具体方法：生理盐水溶解FSH,，每天早(7:008:00) 和晚(19:00
7、20:00)注射两次，连续4d，按递减法注射。其中在第2d晚,第3d早同时注射氯前列烯醇（0.1mg/只）,并在第3d早撤除阴道栓。 3.5.1.5 供体羊发情鉴定及配种 DB51/T 12992011 3 在供体母羊撤除阴道栓后，每隔8h用试情公羊观察发情情况，发情后每隔8h12h配种至发情结束（自然交配或人工授精）。发情配种当天计为0d,在第5d用腹腔镜检查卵巢反应，适宜手术回收胚胎者在第6d用手术法回收子宫胚胎。 3.5.1.6 人工授精操作要求 母羊外阴部必须经过清洗消毒，输精器必须保持无菌，选择合适的输精部位，每次输精有效精子数不少于106个。 3.5.2 胚胎回收与质量鉴定 3.5
8、.2.1 用腹腔镜观察卵巢反应及生殖器官状况，对超排有反应的供体进行手术法从子宫角回收胚胎。 3.5.2.2 手术前将手术羊空腹 24h,用 2%普鲁卡因在荐椎与第一尾椎结合处实行尾椎硬膜外腔麻醉 （或用其他有效方法），将羊保定在手术床上,术部剃毛、消毒。 3.5.2.3 手术部位在乳房外侧的鼠蹊部，切口 8 cm,按常规操作切开,牵引出子宫及卵巢,观察卵巢状况并记录黄体数和卵泡数。经子宫角利用专用胚胎回收针回收胚胎。 胚胎回收液配方和配制说明见附录。 3.5.2.4 将装胚胎回收液的集卵杯静置 2min5min 后，置于体视显微镜下(1520)检卵,并用新鲜的操作液体净化胚胎 2 次3 次，
9、在 60 倍下对胚胎进行形态质量分级。 胚胎保存液配方见附录。 3.5.2.5 依据胚胎质量分级 适宜胚胎移植的胚龄为5.5d6.5d，正常发育阶段为桑葚胚和囊胚。依据胚胎形态和发育阶段与日龄是否相符，将胚胎分为A、B、C、D四级，其中前三级为可移胚，D级胚为不可移胚胎。 A级：优质胚胎，胚胎发育阶段与胚龄一致。细胞分裂为大小、颜色、结构一致的均匀球形体，细胞界限明显，透明带圆而平滑； B级：胚胎发育阶段与胚龄基本一致。有少数几个细胞分裂球被挤出细胞团，其余大部分分裂球为大小、颜色、结构一致的均匀球形体，细胞界限明显，透明带圆而平滑； C级：有部分细胞分裂球（50%）被挤出细胞团，但细胞没有破
10、损，部分细胞界限不清，结构较松散；胚胎发育阶段与胚龄不太一致。 D级：透明带变型，内细胞团变暗，卵裂球界限不清或细胞萎缩，卵裂球周隙增大，或晚发育胚或未受精卵。 3.6 胚胎冷冻保存 3.6.1 冷冻前，在室温下（）用胚胎保存液清洗胚胎次次，将胚胎移入冷冻保护液内，脱水平衡minmin 后将胚胎装入冷冻细管，每管装入胚胎枚枚，将细管热封并作好标记。 胚胎保存液和冷冻保护液配方见附录。 3.6.2 将细管放入在的冷冻仪支架上并放入冷冻室里启动冷冻程序。 3.6.3 冷冻程序 DB51/T 12992011 4 降至.，其降温速度分钟，.人工诱发结 晶，结晶方法是在25 cm镊子上缠绕脱脂棉做成棉
11、签状，并提前将镊子浸入液氮，诱发结晶时，一手持镊子从冷冻室提起胚胎细管，另一手用预冷的棉签紧贴细管含胚段中部，可见白色结晶向上下扩散，待整段结晶后将细管迅速放回冷冻室，在.平衡10 min；从-6.5降至-36，降温速度0.3/min；降温至-36时，将胚胎细管直接投入液氮保存。 3.6.4 胚胎解冻 将液氮中保存的胚胎细管取出，在室温下空气中停留15s后投入32水浴快速解冻。60s后，将胚胎驱入解冻液，平衡8min10min，一步脱除保护剂，然后移入含20% 新生犊牛血清的液中。 胚胎冷冻液配方见附录。 3.6.5 将解冻的胚胎置体视显微镜下进行形态学质量鉴定，方法见 3.5.2.5。 3.
12、7 重复超排 选择首次超排效果较好的供体母羊进行重复超排。两次超排间隔应有个个情期。第一次超排效果不好的母羊和个别手术失误的不宜再超排。 3.8 受体同期发情处理及胚胎移植 3.8.1 受体同期发情处理 3.8.1.1 同期发情处理药品 羊实用型炔诺酮阴道栓 FSH（垂体促卵泡素） PG（氯前列烯醇） 以上药物推荐生产厂见附录。 3.8.1.2 同期发情处理药品剂量 使用剂量见附录。 3.8.1.3 同期发情处理方法 程序1：阴道放置孕激素阴道栓(第0d)，第11d撤栓，同时肌注低剂量FSH ； 程序2：放置炔诺酮阴道栓（第0d），第10d肌注低剂量FSH ，12h后撤栓，同时二次肌注FSH
13、，并注射PG ； 程序3：肌注PG (第0d)，第6d放置炔诺酮阴道栓，16d肌注低剂量FSH ，12h后撤栓，同时二次肌注FSH ，并注射PG 。 使用剂量见附录。 3.8.2 受体羊的发情鉴定 从撤栓后12h开始，每隔12h用试情公羊试情，观察发情情况，母羊接近公羊、摇尾、接受公羊爬跨或母羊互相爬跨者判定为发情，撤栓后96h内发情者为同期发情处理有效。记录发情羊号，并继续试情、记录每只羊的发情持续期，观察到一次发情者持续期记为12 h、观察到二次发情者持续期记为24 h，依此类推，直到连续发情结束。 3.8.3 胚胎移植适宜受体羊的判定方法 DB51/T 12992011 5 将与供体发情
14、同步差在d的受体羊作备查受体。 方法1： 在发情结束后5 d用腹腔镜观察发情羊 卵巢上排卵及黄体发育情况，记录黄体侧别及黄体数和质量，并记录未排卵卵泡大小及数量，卵巢上卵泡正常发育、排卵并形成正常功能黄体，同时卵巢上无卵泡或只有较小卵泡的受体羊作为可用受体，于5d6 d进行手术胚胎移植。 方法2： 在手术时探察并记录卵巢上排卵及黄体发育情况，排卵并发育为功能黄体的受体可进行胚胎移植。 3.8.4 胚胎移植 3.8.4.1 受体胚胎移植手术前应停食 12h 至 24 h，术部于手术前 1d 剃毛。 3.8.4.2 术前麻醉、保定、手术部位及手术移植的基本过程与手术回收相同。 3.8.4.3 在子
15、宫角前端 l/3 处避开血管把装有胚胎的移植针针头插入子宫腔，轻轻晃动针头，确认针头在子宫腔时注入胚胎。注意避免注入过多空气。移植结束后，将子宫送回腹腔，常规缝合。 3.8.4.4 胚胎移植手术时，应尽量减轻手术损伤。操作要轻巧，动作要稳妥可靠，避免过度牵拉生殖器官，禁止挤压卵巢。 3.9 供、受体羊术后管理及妊娠受体的护理 3.9.1 供、受体羊手术后注意术后护理，尤其是伤口护理。手术后 8d10d 根据伤口愈合情况拆线，进行外科处理。 3.9.2 继续加强供体羊饲养管理，注意观察发情、及时配种。 3.9.3 加强移植胚胎受体羊的饲养管理，注意观察发情，如果返情应及时配种。 3.9.4 适当
16、增加日粮营养，以满足妊娠需要，避免应激反应，防止流产。 3.9.5 妊娠后期要补充足量的维生素、矿物元素，适当限制摄入量，既要保证胎儿的正常发育，又要避免难产。 3.9.6 根据当地疾病发生情况，有目的地注射一些疫苗，防止胎儿传染病的发生。 3.9.7 做好分娩时的难产预防和羔羊护理工作。 DB51/T 12992011 6 AA 附 录 A （资料性附录） 胚胎移植技术所需器械、物品、仪器 品名 规格 数量 品名 规格 数量 A.1 器械、物品 染发精 盒 1/40 羊 写号笔(写 放大号) 只 2 耳号钳 把 1 试管刷 个 5 耳号牌 付 1 付/羊 硫酸纸 米 若干 毛巾 条 若干 饭
17、盒 个 5 工作服 件 5 针盒 个 5 胶鞋 双 5 线手套 双 5 雨鞋 双 5 敷料镊子(25cm) 毛剪 把 1 线绳 把 2 保定绳 根 若干 肥皂 块 若干 剃毛刀架 付 2 剃毛刀片 合 若干 剪刀 把 1 广口瓶 个 5 羊用开膣器(大,小) 把 各 1 肠钳(去栓备用) 把 1 一次性注射器(2,5,10mL) 支 若干 针头(9 号) 合 若干 阴道栓置入器 牛皮纸 张 若干 脱脂纱布(止血) 卷 3 针头滤器 个 5 胶布 卷 1 纱布条 脱脂棉 卷 2 0.22u 滤膜 盒 1 手术口罩 只 8 只/次 0.22u 滤膜 盒 1 医用手套 双 2 双/供体 手术衣 件
18、8 手套包巾 块 5 滑石粉 Kg 1 手术灯(家用万向灯代替) 台 2 手刷 个 2 手术器械盘 个 3 纱布杯子(烧杯或其他) 个 2 创巾(白纯绵布自制1.5x1m) 块 若干 器械包巾(白布自制) 块 6 巾钳(14cm) 把 若干 镊子(有齿、无齿) 把 若干 手术刀柄(4#) 把 6 手术刀片(21-24#) 包 5 止血钳(16cm) 把 若干 手术剪刀 把 6 缝合线(白色 7、10 号) 卷 6 缝合针(3 /8,11/40 或10/36) 包 各 1 绕线芯 个 6 手臂消毒桶 羊 2 肠钳 把 5 手术帽 只 6 只/次 室内温度计 个 2 持针器 把 6 血管夹(5.7
19、 弯) 个 4 注射器(玻璃) 5mL 10 注射器封闭胶头 个 10 注射器（10 mL,30 mL） 个 若干 胚胎回收出液针头 枚 4 异物针 把 2 胚胎冲洗进液针头 枚 10 吸管胶头 个 10 DB51/T 12992011 7 集卵杯(90mm蒸发皿代替) 个 20 胚胎吸管、移植管 枚 若干 带盖检卵(胚)杯 个 50 带盖器械盘 个 2 针头(6,12 号) 盒 各2 乳胶管,玻璃珠,硅胶管 酒精灯 个 2 擦镜纸 本 1 移植针 枚 12 A.2 药物 感染伤口处理药品(备用) 生理盐水 瓶 若干 碘化酒精(自配) 瓶 若干 防粘连药剂 新洁尔灭 瓶 若干 医用酒精 kg
20、若干 碘酊 瓶 若干 伤口处理药粉 Kg 0.5 肾上腺素或苏醒灵 支 50 单、双蒸馏水 A.3 仪器 鼓风干燥箱 台 1 腹腔镜保定架 1 蒸馏器 桶 各 1 腹腔镜 套 1 紫外线杀菌灯(30W) 套 4 电炉(2000W,800W) 台 各 1 体视显微镜 台 1 高压蒸汽灭菌器 台 1 电加热器或空调 台 1 手术台 个 4 水浴锅(三用水箱) 台 1 冰箱 台 1 A.4 记录表格 侯选供受体情况表 份 1/20 羊 供体超排 胚胎回收记录 份 1/1 羊 胚胎冷冻及其他操作记录 份 1/羊 受体同期发情记录 份 1/20 羊 胚胎移植 产羔记录 份 1/20 羊 供体羊术后情况记
21、录 份 1/20 羊 受体术后情况记录 份 若干 工作进度汇总表 份 2 DB51/T 12992011 8 BB 附 录 B （资料性附录） 推荐药物剂量及生产厂家、溶液配方及配制 B.1 推荐药物剂量及生产厂家 剂量 药物 供体 受体 生产厂家 FSH(垂体促卵泡素) 810mg/只 中国科学院动物研究所，10mg/瓶 810ml/只 加拿大生 产 （澳大利亚进口）， 10ml/瓶 （使用时配成水剂）300350 小鼠单位 3350 小鼠单位宁波激素制品有限公司，100 小鼠单位/支 PG（氯前列烯醇） 0.2 ml/只 0.1 ml/只 上海计划生育研究所，0.2 mg/ 2ml/支 孕
22、激素阴道栓 60 mg/只 60 mg/只 西北农林科技大学胚胎工程实验室试制，每枚含 18-甲基炔诺酮 60 mg LRH-A3（促排卵素 3 号） 20g/只 宁波激素制品有限公司，20g/ 2ml/支 B.2 杜氏磷酸盐缓冲液（PBS）配方 成分 指标（克/升） 配制说明 NaCl KCl Na2HPO4(Na2HPO412H 2O) KH2PO4CaCl2(CaCl22H 2O) MgCl2(MgCl26H 2O) 丙酮酸钠 葡萄糖（葡萄糖H 2O） 青霉素 链霉素 酚红 8.00 0.20 1.15（2.916） 0.20 0.10（0.132） 0.10（0.2133） 0.036 1.00（1.10） 0.075 0.05 所有成分必须是分析纯以上的化学制剂； 所用水是玻璃器皿蒸馏的三重蒸馏水； 配好的液需过滤灭菌、PH 值为 7.2-7.6，渗透压为 270-290mos、冷藏保存（4-5） 。 B.3 胚胎回收液 5%灭活新生犊牛血清的PBS液 B.4 胚胎保存液 DB51/T 12992011 9 20%灭活新生犊牛血清的PBS液 B.5 胚胎冷冻保护液 1.5M乙二醇、0.1M蔗糖、20%灭活新生犊牛血清的PBS液 B.6 解冻液 0.5M蔗糖、20% 灭活新生犊牛血清的PBS液 _
