1、 ICS 11.220 B 41 DB51 备案号：30901-2011 四川省地方标准 DB51/T 12982011 山羊传染性胸膜肺炎诊断技术规范 Technical Specification for Diagnostic Methods of Contagious Caprine Pleuropneumonia 2011 - 06 - 27 发布 2011 - 07 - 01 实施四川省质量技术监督局 发布DB51/T 12982011 I 目 次 前 言 . II 1 范围 1 2 规范性引用文件 1 3 术语与定义 1 4 临床症状与剖检变化 1 5 病原分离与鉴定 2 附录A（
2、资料性附录） 培养基 6 附录B（资料性附录） 试剂配制 7 DB51/T 12982011 II 前 言 本标准的附录A、附录B为资料性附录。 本标准由四川省畜牧食品局提出并归口。 本标准由四川省质量技术监督局批准发布。 本标准起草单位：西南民族大学 四川省畜禽繁殖改良总站。 本标准主要起草人：杨发龙 岳华 王永 汤承 傅昌秀。 DB51/T 12982011 1 山羊传染性胸膜肺炎诊断技术规范 1 范围 本标准规定了山羊传染性胸膜肺炎的病原分离培养及山羊支原体山羊肺炎亚种聚合酶链式反应检测的技术要求。 本标准适用于山羊传染性胸膜肺炎的诊断，聚合酶链式反应适用于山羊支原体山羊肺炎亚种的检测与
3、鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语与定义 下列术语和定义适用于本标准。 3.1 山羊传染性胸膜肺炎 Contagious Caprine Pleuropneumonia 是由山羊支原体山羊肺炎亚种感染山羊而引起的一种以呼吸道症状为主要特征的传染病。 3.2 聚合酶链式反应 polymerase chain reaction （PCR） 是一种 分子生物学 技术，用于体外大量扩增特定的D
4、NA片段。 3.3 引物 primer 是人工合成的两段寡核苷酸序列，用于聚合酶链式反应，其中一条引物与目标片段一端的一条DNA模板链互补，另一条引物与目标片段另一端的另一条DNA模板链互补。 4 临床症状与剖检变化 4.1 临床症状 该病的典型临床症状表现为极度高热（41-43），随后2d-3d出现明显的呼吸道症状，表现为呼吸加速、显得痛苦、有时发现呼噜声，出现持续性的剧烈咳嗽。在疾病后期病羊不能运动、两前肢分开站立、脖子僵硬前伸，有时嘴里不断流出涎液。 4.2 剖检变化 本病的病变多局限于胸腔内。多在一侧肺脏发生严重的浸润和明显的肝变，其肝变区凸出肺表面，颜色由红至灰不等。病肺质硬而没有弹
5、性，切面呈大理石状。纤维蛋白渗出液充盈使肺小叶间组织变宽，DB51/T 12982011 2 小叶界限明显。胸腔常积有淡黄色胸水，暴露于空气后，可发生纤维蛋白凝块。胸膜变厚而粗糙，有的与胸腔粘连 5 病原分离与鉴定 5.1 病料采集及运输 5.1.1 活体病料的采集 将无菌棉拭子伸入发病山羊的鼻腔，采集分泌物。 5.1.2 剖检病料的采集 用无菌技术，采集肺组织（病健交界处最好）、胸腔渗出液及纵隔淋巴结。 5.1.3 病料运输 采集的病料在低温条件下尽快（24h内）送到实验室进行检测，如果检测不能及时进行，应保存在-20。 5.2 病原分离 5.2.1 培养基 改良Thiaucourt s液体
6、培养基、改良Thiaucourt s固体培养基(见附录A)。 5.2.2 病料处理 5.2.2.1 鼻拭子 将拭子浸入2mL-3mL的改良Thiaucourt s液体培养基中，反复挤压，将分泌物悬浮于培养基中。 5.2.2.2 组织样本 采用无菌技术，取2g组织样本，放入2mL改良Thiaucourt s液体培养基，并在其中用剪刀将其剪成小的碎块，强烈震荡，3000r/min离心5min，取上清。 5.2.2.3 胸腔渗出液 直接加入到改良Thiaucourt s液体培养基中。 5.2.3 培养 将上述鼻拭子悬液、 组织悬液及胸腔渗出液均用改良Thiaucourt s液体培养基进行101-10
7、5倍系列稀释。同时，各稀释度划线接种固体培养基平板，平板用封口膜密封，置37培养。逐日进行观察，观察液体培养物颜色有无发生变化，5d-7d后判定。固体培养基上生长菌落的观察在体视显微镜下进行，对可疑菌落进行连续3代纯化。 5.2.4 结果判定 5.2.4.1 培养性状和菌落形态 DB51/T 12982011 3 山羊支原体山羊肺炎亚种在改良Thiaucourt s液体培养基中培养3d-5d后， 使培养基颜色发生变化，呈轻微混浊，无菌膜、无沉淀、无颗粒悬浮。在琼脂平板上生长迟缓，形成极小的水滴状圆形、透明菌落，需用放大镜或低倍显微镜进行观察。菌落中央有乳头状突起，呈“煎蛋状”。 5.2.4.2
8、 染色镜检 取液体培养物或固体培养基上菌落涂片，姬姆萨氏染色法染色，1000倍显微镜下观察。菌体多呈球杆状、丝状。 5.3 聚合酶链式反应 5.3.1 主要设备 5.3.1.1 PCR 扩增仪 5.3.1.2 电泳仪、水平电泳槽 5.3.1.3 凝胶成像系统 5.3.1.4 冷冻高速离心机 5.3.1.5 微量高速离心机（适合于对 PCR 反应管进行离心操作） 5.3.1.6 高压灭菌锅 5.3.1.7 恒温水浴锅 5.3.1.8 移液器（0.1 L-10L、2 L-20L、20 L-200L、200 L-1000L） 5.3.2 主要试剂 5.3.2.1 引物（10 mol/L） P1（上游
9、引物）：5 -ATCATTTTTAATCCCTTCAAG-3 P2（下游引物）：5 -TACTATGAGTAATTATAATATATGCAA-3 5.3.2.2 DNA 提取试剂 蛋白酶K、十二烷基硫酸钠（SDS）、酚、氯仿、异戊醇、无水乙醇。 5.3.2.3 PCR 反应试剂 Taq DNA聚合酶（5U/ L）、MgCl 2（25mmol/L）、dNTP（每种浓度为2 .5mmol/L）、10 PCR Buffer(无Mg2+)。 5.3.2.4 STE 缓冲液（组成及配制方法见附录 B） 5.3.2.5 TAE 电泳缓冲液（组成及配制方法见附录 B） 5.3.2.6 6上样缓冲液（6 Lo
10、ading Buffer） 5.3.2.7 琼脂糖（电泳级） 5.3.2.8 溴化乙锭（1mg/mL） 5.3.2.9 DNA 分子量标准（100bp,200bp, 300bp,400bp,500bp,600bp）。 5.3.2.10 水 所用水应符合GB/T 6682中三级水（三蒸水）规格。 DB51/T 12982011 4 5.3.3 DNA 提取 5.3.3.1 样本处理 组织样本：肺等组织样本，按1g加入1mL的STE，进行研磨，300 0r/min进行离心10min，取上清液，12000r/min进行离心2 0min，弃上清，沉淀用于DNA提取。 棉拭子：将鼻腔拭子等棉拭子浸入1m
11、L的STE缓冲液中 30min，反复挤压，然后以12000r/min离心20min，弃去上清，收集沉淀用于DNA提取。 胸腔渗出液：取500 L胸腔渗出液，加入500 L STE缓冲液，混匀，12000r/min离心20min, 弃上清，收集沉淀用于DNA提取。 液体培养物：12000r/min离心20min, 弃上清，收集沉淀用于DNA提取。 5.3.3.2 DNA 提取方法 向上述沉淀中加入500 L STE缓冲液，使其重悬。加入10%SDS溶液20 L，20mg/mL 蛋白酶K10 L，混匀，在56水浴60min。加入等体积的酚/氯仿/异戊醇（25:24 :1），混匀，12000r/mi
12、n离心5min。转移上清到另一离心管中，加入等体积的氯仿/异戊醇（24:1），颠倒混匀，12000 r/min离心5min。取上清，加入2.5倍体积的预冷无水乙醇，-20沉淀30min，12000r/min离心5min，弃去上清液。用1mL 70%乙醇漂洗，重复2-3次，12000r/min离心5min。室温干燥，DNA沉淀用25 L无菌三蒸水溶解作为模板，-20保存备用。 5.3.4 PCR 扩增 每次对检测样品进行PCR扩增时，均需要设置阳性和空白对照。 PCR反应总反应体系25 L，包括以下成份：10 PCR Buffer 2.5L、MgCl 2（25mM）2 L、dNTP(2.5mM)
13、 2L、 TaqDNA聚合酶(5U/ L) 0.125L、引物P1（10 mol/L）1 L、引物P2（10 mol/L）1 L、水14.375 L、模板DNA（空白对照用水代替）2 L。 PCR反应条件为95 预变性5min，然后进行 95 1min, 48 1min, 72 30s的循环，进行35个循环，最后72 延伸 10min，4保存。 5.3.5 PCR 产物的电泳检测 用 TAE 电泳缓冲液配制成 2%琼脂糖凝胶（见附录 B）。取 5 L PCR 产物与 1 L 6上样缓冲液混合，分别加入样品孔，同时在一加样孔中加入 DNA 分子量标准，以 5V/cm 恒压电泳，采用凝胶成像系统进
14、行拍照。 5.3.6 结果判定 阳性对照出现一条316bp左右大小的条带，且无模板空白对照不出现条带，见图1。 在满足上述条件的情况下， 被检样品的PCR产物经电泳后出现一条316bp左右的条带判定为阳性 （+） ；被检样品的PCR产物经电泳后不出现316bp左右的条带判定为阴性（）。 DB51/T 12982011 5 说明： M DNA 分子量标准； P 阳性对照； N 阴性对照。 图1 阴、阳性对照 PCR 电泳图 DB51/T 12982011 6 AA 附 录 A （资料性附录） 培养基 A.1 改良 Thiaucourts 培养基 A.1.1 组成 PPLO 肉汤 650mL； 健
15、康马血清 250mL； 25%酵母浸出液 100mL； 50%葡萄糖溶液 4mL; 25%丙酮酸钠溶液 8mL; 1%醋酸铊溶液 25mL; 青霉素 20 万单位； 0.4%酚红溶液 5mL; A.1.2 制备方法 制备时，将 PPLO 肉汤进行 121 30min 高压蒸汽灭菌，其他成分滤过除菌，待 PPLO 肉汤降温至 55-60时，其他成分与其混合，用灭菌的 1mol/L氢氧化钠溶液调节 pH 至 7.6-7.8. 制备固体培养基时，在 PPLO 肉汤中加入培养基总体积 1.5%的琼脂，加热溶解后 121 30min 高压蒸汽灭菌，待温度降至 55-60时与其他成分混合，固体培养基中不含
16、酚红。 DB51/T 12982011 7 BB 附 录 B （资料性附录） 试剂配制 B. 1 STE 缓冲液 0.1 mol/L NaCl 10 mmol/L Tris.HCl(pH8.0) 1 mmol/L EDTA (pH8.0) B.2 TAE 电泳缓冲液（pH8.0） 50TAE 电泳缓冲液贮存液： Tris 碱 242g EDTA 37.2g 冰乙酸 57.1mL 加双蒸水至 1000mL，应用前用双蒸水将 50TAE 电泳缓冲液进行 50 倍稀释。B.3 2%的琼脂糖电泳凝胶板制备 琼脂糖 2g 1TAE 电泳缓冲液 100mL 将琼脂糖放入 TAE 电泳缓冲液中，加热融化，温度降至 60左右时加入溴化乙锭（终浓度 0.5g/mL），混匀，均匀倒板，厚度为 3mm-5mm。 _
