1、ICS 11.220 B 41 DB51 备案号：30887-2011 四川省地方标准 DB51/T 12842011 空肠弯曲杆菌分离鉴定技术规范 2011- 06 - 27 发布 2011 - 07 - 01 实施四川省质量技术监督局 发布DB51/T 12842011 I 目 次 前 言 . II 1 范围 1 2 规范性引用文件 1 3 术语和定义 1 4 空肠弯曲杆菌的分离鉴定 1 附录A（资料性附录） 培养基和试剂制备 4 DB51/T 12842011 II 前 言 本标准附录A为资料性附录 本标准由四川省畜牧食品局提出并归口 本标准由四川省质量技术监督局批准 本标准由四川省动物
2、疫病预防控制中心负责起草 本标准起草人：张焕容、余 勇、张 东、毛光琼、汤 承、岳 华、陈代平、郭 莉、吴 宣、李金海、罗 毅DB51/T 12842011 1 空肠弯曲杆菌分离鉴定技术规范 1 范围 本标准规定了空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)的分离鉴定方法。 本标准适用于鸡、鸭、鹅、野禽、猪、牛等多种畜禽空肠弯曲杆菌的分离与鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 4789.28 食品卫生微生物学检验染色法、培养
3、基和试剂。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法。 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 3.1 空肠弯曲杆菌 Campylobacter jejuni 可致多种动物和人腹泻，在环境及健康动物体内广泛存在。菌体大小为 0.3 m 0.4m 1.5m3.0m，弯曲杆状或海鸥展翅状，暴露于空气中后很快形成球状体，革兰氏染色阴性。 3.2 聚合酶链式反应 Polymerase chain reaction, PCR 是一种分子生物学技术，用于体外大量扩增特定的 DNA 片段 3.3 引物 Primer 是人工合成的两段寡核苷酸序列，用于聚合酶链式反应，其中一条引物与目标片段一端的
4、一条 DNA模板链互补，另一条引物与目标片段另一端的另一条 DNA 模板链互补。 4 空肠弯曲杆菌的分离鉴定 4.1 设备和材料 4.1.1 二氧化碳培养箱 4.1.2 微量移液器（0.1L 10L、2L 20L、20L200L、200L 1000L）及相应型号的无菌吸头 DB51/T 12842011 2 4.1.3 微型离心机（适合于对 PCR 反应管进行离心操作） 4.1.4 无菌工作台 4.1.5 接种环、接种针、酒精灯及酒精棉球 4.1.6 PCR 扩增仪及电泳仪 4.2 培养基和试剂（见附录 A） 4.2.1 改良 Skirrow 氏琼脂基础培养基（Skirrow Agar Bas
5、e, Modified） 4.2.2 空肠弯曲杆菌琼脂基础培养基（Campylobacte r Agar Base） 4.2.3 Cary-Blair 氏运送培养基（Cary-Blair Transport Medium） 4.2.4 革兰氏染色液 4.2.5 TAE 缓冲液 4.2.6 琼脂糖及显色液 4.2.7 相关生化试剂 3过氧化氢溶液、1%盐酸二甲基对苯二胺溶液、1%-萘酚乙醇溶液、甘氨酸、醋酸铅培养基、马尿酸钠培养基、三氯化铁、萘啶酸、硝酸盐培养基、对氨基苯磺酸、醋酸、-奈胺、TTC 琼脂基础培养基。 4.2.8 PCR鉴定相关试剂 Taq DNA聚合酶 （5U/L） 、 MgCl
6、2（25mmol/L） 、 dNTP（每种浓度为 2.5mmol/L） 、10PCR Buffer(无Mg2+)。 4.2.9 分离培养 4.2.10 用灭菌棉签无菌采集动物的泄殖腔（肛门）、空肠、盲肠内容物。 4.2.11 将采样棉签放入运送培养基带回实验室划线或直接划线于 Skirrow 氏培养基平板。 4.2.12 将该平板置于 42、10%二氧化碳的培养箱中培养 48h。 4.2.13 挑取疑似空肠弯曲杆菌的单个菌落（直径 1mm2mm、透明、表面光滑），革兰氏染色镜检。 4.2.14 将革兰氏染色镜检疑似空肠弯曲杆菌的菌落接种于空肠弯曲杆菌琼脂基础培养基平板上，置于42、10%二氧化
7、碳的培养箱中纯化培养 24h48h。 4.2.15 在空肠弯曲杆菌琼脂基础培养基平板上再挑取单个菌落革兰氏染色镜检，若含有其他杂菌，需重复 4.3.5 继续纯化直到革兰氏染色镜检为弯曲杆菌为止。 4.3 细菌鉴定 4.3.1 细菌染色鉴定 革兰氏染色镜检为G-。 4.3.2 生化鉴定（ “+”为阳性反应，“-”为阴性反应） 触酶试验（+）、氧化酶试验（+）、甘氨酸试验（+）、硫化氢试验（-）、马尿酸钠试验（+）、萘啶酸抑制试验（+）、硝酸盐还原试验（-）和 TTC 试验（+）。 4.3.3 PCR 鉴定 DB51/T 12842011 3 4.3.3.1 PCR 引物 上游引物：5-AGCTA
8、GCTTCGCA TAATAACTTG-3 下游引物：5-GAAGAGGGTTT GGGTGGTG-3 4.3.3.2 模板制备 细菌液体培养物 12000r/min 离心 20min， 弃上清，收集沉淀用于模板 DNA 提取。向上述沉淀中加入 500 L STE 缓冲液，使其重悬。加入 10%SDS 溶液 20 L， 20mg/mL 蛋白酶 K10L ，混匀，在 56水浴 60min。加入等体积的酚/ 氯仿/ 异戊醇（25:24:1），混匀，12000r/min 离心 5min。转移上清到另一离心管中，加入等体积的氯仿/ 异戊醇（ 24:1），颠倒混匀， 12000r/min 离心 5min
9、。取上清，加入 2.5倍体积的预冷无水乙醇， -20沉淀 30min， 12000r/min 离心 5min，弃去上清液。用 1mL 70%乙醇漂洗，重复 2-3 次， 12000r/min 离心 5min。室温干燥， DNA 沉淀用 25 L 无菌三蒸水溶解作为模板， -20保存备用。 4.3.3.3 PCR 扩增 每次对检测样品进行 PCR 扩增时，均需要设置阳性和空白对照。 PCR反应总反应体系 25L，包括以下成份： 10PCR Buffer 2.5 L、 MgCl2（25mM） 2L 、 dNTP(2.5mM) 2L、 Taq DNA聚合酶(5U/ L) 0.2L、上游引物（20 m
10、ol/L） 1L、下游引物（20 mol/L） 1L、水 14.3L、模板DNA（空白对照用水代替）2 L。 PCR 反应条件为 95 预变性 5min，然后进行 95 1min， 58 1min， 72 1min ， 30 个循环，最后 72 延伸 10min， 4保存。 4.3.3.4 PCR 产物的电泳检测 用 TAE 电泳缓冲液配制成 2%琼脂糖凝胶（见附录 A）。取 5L PCR 产物与 1L 6 倍上样缓冲液混合，分别加入样品孔，同时在另一加样孔中加入 DNA 分子量标准，以 5V/cm 恒压电泳，采用凝胶成像系统进行拍照。在阳性和空白对照成立的前提下，待检样品如果为阳性，则出现一
11、条与阳性对照同步迁移的目的条带。 4.3.3.5 结果判定 凡符合空肠弯曲杆菌的革兰氏染色特征、生化特性以及 PCR 鉴定呈阳性的菌株，均判为空肠弯曲杆菌。 DB51/T 12842011 4 AA 附 录 A （资料性附录） 培养基和试剂制备 A.1 试剂及制备 A.1.1 三氯化铁：FeCl 3.6H2O 12g溶于2%盐酸溶液100mL即成。 A.1.2 氧化酶试剂 1%盐酸四甲基苯二胺水溶液，或 1%盐酸二甲基对苯二胺水溶液，配制后盛于棕色瓶中，置冰箱中可保存 2 周，若冰冻保存可用 4 周6 周。 A.1.3 3%过氧化氢（H 2O2） 30%过氧化氢 10mL 蒸馏水 90mL 装
12、于棕色玻璃瓶中，有效期为一周。 A.1.4 1%甘氨酸培养基 布氏肉汤 1000 mL 琼脂 1.6 g 甘氨酸 10.0 g 将以上成分混合，加热溶解，校正PH7.00.2，分装13mm100mm 试管，每支约4mL左右，121高压灭菌15min，备用。 A.1.5 含30g萘啶酸的圆形滤纸片。 A.1.6 快速硫化氢(H 2S)试验琼脂 蛋白胨 15.0g 示胨 5.0g 牛肉浸粉 3.0g 酵母浸粉 3.0g 氯化钠 5.0g 硫酸亚铁 0.2g 硫代硫酸钠 0.3g 琼脂 4.0g 蒸馏水 1000ml pH 7.4 115高压蒸汽灭菌 15min，待冷却至 5060，按 5%的比例加
13、入灭活血清，分装于小试管中，待凝固后，用于接种细菌。 A.1.7 STE缓冲液：0.1 mol/L NaCl、 10 mmol/L Tris.HCl(pH8.0)和1 mmol/L EDT A (pH8.0)。 DB51/T 12842011 5 A.1.8 TAE缓冲液 50TAE电泳缓冲液贮存液：Tris碱 242g、EDTA 37.2 g和冰乙酸 57.1mL混合，加双蒸水至1000mL，应用前用双蒸水将50TAE电泳缓冲液进行50倍稀释。 A.1.9 PCR鉴定相关试剂（10 PCR Buffer 、6 loading buffer、 MgCl 2、 dNTP、 Taq DNA 聚合酶、引物等均由生物公司购得） A.1.10 其它试剂以及药品 ： 5%氯化钠、硝酸盐溶液、0.02%盐酸半胱氨酸、乙酸、FeCl 3、硫酸亚铁(FeSO4.7H2O )、甲萘胺、对氨基苯磺酸、偏亚硫酸钠、无水磷酸氢二钠、无水磷酸二氢钾、丙酮酸钠。A.1.11 2%琼脂糖凝胶板的制备 称取 2g 琼脂糖，加入盛有 100mLTAE 缓冲液锥形瓶中，然后将三角瓶放在微波炉中加热至琼脂糖充分溶解，再加入 0.8L 显色液，轻轻晃动混和均匀。 _
