1、ICS 11.220 B 41 DB51 备案号：30885-2011 地方标准 DB51/T 12822011 猪副嗜血杆菌分离鉴定技术规范 2011 - 06 - 27 发布 2011 - 07 - 01 实施四川省质量技术监督局 发布DB51/T 12822011 I 目 次 前 言 . II 1 范围 1 2 规范性引用文件 1 3 术语和定义 1 4 猪副嗜血杆菌的分离鉴定 1 附录A（资料性附录） 培养基和试剂制备 4 DB51/T 12822011 II 前 言 本标准附录A为资料性附录。 本标准由四川省畜牧食品局提出并归口。 本标准由四川省质量技术监督局批准。 本标准由四川省动
2、物疫病预防控制中心负责起草。 本标准起草人：岳 华、余 勇、张 东、张焕容、汤 承、杨发龙、于学辉、阳爱国、陈代平、陈 斌、罗 毅、张代芬 DB51/T 12822011 1 猪副嗜血杆菌分离鉴定技术规范 1 范围 本标准规定了猪副嗜血杆菌（ Haemophilus Parasuis,HPs）的分离鉴定方法。 本标准适用于猪副嗜血杆菌的分离鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 4789.28 食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂。
3、GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法。 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 3.1 猪副嗜血杆菌 Haemophilus Parasuis,HPs 猪副嗜血杆菌为嗜血杆菌属中的一种细菌，为酶系统发育不完全的革兰氏阴性杆菌，生长需要血液中的生长因子，尤其是 X 因子和 V 因子。 3.2 聚合酶链式反应 Polymerase cha in reaction, PCR 是一种分子生物学技术，用于体外大量扩增特定的 DNA 片段。 3.3 引物 Primer 是人工合成的两段寡核苷酸序列，用于聚合酶链式反应，其中一条引物与目标片段一端的一条 DNA模板链互补，另一条引物与目标片
4、段另一端的另一条 DNA 模板链互补。 4 猪副嗜血杆菌的分离鉴定 4.1 设备和材料 4.1.1 二氧化碳培养箱 4.1.2 微量移液器（0.1L10L、2L20L、20L200L、200L1000L）及相应型号的无菌吸头 DB51/T 12822011 2 4.1.3 微型离心机（适合于对 PCR 反应管进行离心操作） 4.1.4 无菌工作台 4.1.5 接种环、接种针、酒精灯及酒精棉球 4.1.6 PCR 扩增仪及电泳仪 4.2 培养基和试剂（见附录 A） 4.2.1 胰蛋白胨大豆琼脂培养基（Tryptone Soy Agar, TSA） 4.2.2 胰蛋白胨大豆肉汤（Trypcasei
5、n Soy Broth, TSB） 4.2.3 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD），小牛血清 4.2.4 革兰氏染色液 4.2.5 TAE 缓冲液 4.2.6 琼脂糖及显色液 4.2.7 相关生化试剂 3过氧化氢溶液、1%盐酸二甲基对苯二胺溶液、1% -萘酚乙醇溶液、木糖、果糖、蔗糖、甘露醇、山梨糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、D 核糖和山梨醇。 4.2.8 PCR鉴定相关试剂 Taq DNA聚合酶 （5U/L） 、 MgCl2（25mmol/L） 、 dNTP（每种浓度为 2.5mmol/L） 、10PCR Buffer(无Mg2+)。 4.3 分离培养 4.3.1 分别从濒死猪或死亡不超过 8
6、小时的病（死）猪的关节腔、心包、胸腔、肺脏、心血、气管、腹腔、脑等部位，无菌采集样本接种于含 5%小牛血清和 0.0002NAD 的 TSA 琼脂培养基平板。 4.3.2 将平板置于 5% CO 2 37的培养箱中培养 24h48h。 4.3.3 观察平板上有无疑似 HPs 的菌落。HPs 在 TSA 平板上形成圆形、凸起、透明或半透明的无色小菌落。挑取革兰氏染色符合 HPs 特性的单个可疑菌落划线接种于含 5%小牛血清和 0.0002NAD 的 TSA琼脂培养基平板上，进行纯化 。 4.4 细菌鉴定 4.4.1 细菌染色鉴定 革兰氏染色镜检为G-。油镜下，可见红色球状、杆状、球杆状、长丝状等
7、多形性的菌体。 4.4.2 生化鉴定（ “+”为阳性反应，“-”为阴性反应） 触酶试验（+）、氧化酶试验（-）、木糖（+）、果糖（+）、蔗糖（+）、甘露醇（+）、山梨糖（-）、阿拉伯糖（-）、半乳糖（+）、葡萄糖（+）、D 核糖（-）和山梨醇（+）。 4.4.3 PCR 鉴定 4.4.3.1 PCR 引物 上游引物：5-GTGATGAGGAA GGGGTGGTGT -3 DB51/T 12822011 3 下游引物：5-GGCTTCGTCAC CCTCTGT -3 4.4.3.2 模板制备 细菌液体培养物 12000r/min 离心 20min， 弃上清，收集沉淀用于模板 DNA 提取。向上述
8、沉淀中加入 500 L STE 缓冲液，使其重悬。加入 10%SDS 溶液 20L，20mg/mL 蛋白酶 K10L，混匀，在 56水浴 60min。加入等体积的酚/氯仿/异戊醇（25:24:1），混 匀，12000r/min 离心 5min。转移上清到另一离心管中，加入等体积的氯仿/异戊醇（24:1），颠倒混匀，12000 r/min 离心 5min。取上清，加入2.5 倍体积的预冷无水乙醇，-20沉淀 30min，12000r/ min 离心 5min，弃去上清液。用 1mL 70%乙醇漂洗，重复 2 次3 次，12000r/min 离心 5min。室温干燥，DNA 沉淀用 25L 无菌三
9、蒸水溶解作为模板，-20保存备用。 4.4.3.3 PCR 扩增 4.4.3.3.1 每次对检测样品进行 PCR 扩增时，均需要设置阳性和空白对照。 4.4.3.3.2 PCR 反应总反应体系 25L，包括以下成份：10PCR Buffer 2.5L、MgCl2（25mM）2L 、dNTP(2.5mM) 2L、 Taq DNA 聚合酶(5U/L) 0.2L、 上游引物 （10mol/L） 1L、 下游引物 （10mol/L）1L、水 14.3L、模板 DNA（空白对照用水代替）2L。 4.4.3.3.3 PCR 反应条件为 95 预变性 5min，然后进行 95 1min， 58 1min ，
10、 721min， 30个循环，最后 72 延伸 10min，4保存。 4.4.3.4 PCR 产物的电泳检测 用 TAE 电泳缓冲液配制成 2%琼脂糖凝胶（见附录 A）。取 5L PCR 产物与 1L 6 倍上样缓冲液混合，分别加入样品孔，同时在另一加样孔中加入 DNA 分子量标准，以 5V/cm 恒压电泳，采用凝胶成像系统进行拍照。在阳性和空白对照成立的前提下，待检样品如果为阳性，则出现一条与阳性对照同步迁移的目的条带。 4.4.3.5 结果判定 凡符合猪副嗜血杆菌的革兰氏染色特征、生化特性以及 PCR 鉴定呈阳性的菌株，均判为猪副嗜血杆菌。 DB51/T 12822011 4 AA 附 录
11、 A （资料性附录） 培养基和试剂制备 A.1 胰蛋白胨大豆琼脂培养基（TSA）均由成品粉末按其说明配 制，加热煮沸以至充分溶解，121高压蒸汽灭菌 15min，待冷却至 5060，在无菌工作台中添加 5小牛血清和 0.0002 NAD，倒入一次性平板中，冷却凝固后放入冰箱中备用。 A.2 糖（醇）发酵培养基 LB肉汤 20.00g 酸性复红 0.05g 糖 （醇） 10.00g 溶于1000ml蒸馏水中，110高压灭菌20min，待冷却至5060时，添加5%的灭活小牛血清，0.0002的NAD，分装于小试管中，备用。 A.3 氧化酶试剂 1%盐酸二甲基对苯二胺水溶液，配制后盛于棕色瓶中，现配
12、现用，置冰箱中可保存1周，若冰冻保存可用24周。 A.4 3%过氧化氢（H 2O2），配好后装于棕色玻璃瓶中，有效期为一周。 30%过氧化氢 10ml 蒸馏水 90ml A.5 STE缓冲液：0.1 mol/L NaCl、 10 mmol/L Tris.HCl(pH8.0)和 1 mmol/L EDTA (pH8.0)。 A.6 TAE缓冲液 50TAE电泳缓冲液贮存液：Tris碱 242g、EDTA 37.2 g和冰乙酸 57.1mL混合，加双蒸水至 1000mL，应用前用双蒸水将 50TAE电泳缓冲液进行 50 倍稀释。 A.7 PCR鉴定相关试剂（10PCR Buffer 、 6loading buff er、MgCl 2、dNTP、Taq DNA 聚合酶、引物等均由生物公司购得） A.8 2%琼脂糖凝胶板的制备 称取 2g 琼脂糖，加入盛有 100mLTAE 缓冲液锥形瓶中，然后将三角瓶放在微波炉中加热至琼脂糖充分溶解，再加入 0.8L 显色液，轻轻晃动混和均匀。 _
