1、ICS DB51 四川省地方标准 DB51/T 11752010 饲料中苯乙醇胺 A 的测定 高效液相色谱法 Determination of phenylethanolamine A in feeds High-performance liquid chromatography 2010 - 11 - 16 发布 2011 - 01 - 01 实施四川省质量技术监督局 发布DB51/T 11752010 I 目 次 前言 II 1 范围 1 2 规范性引用文件 1 3 定义 1 4 原理 1 5 试剂和材料 1 6 仪器和设备 2 7 试样制备 2 8 操作方法 2 9 结果计算 3 10
2、重复性 . 4 附录A（资料性附录）色谱图 5 DB51/T 11752010 II 前 言 本标准的附录A为资料性附录。 本标准由四川省畜牧食品局提出并归口。 本标准由四川省质量技术监督局批准。 本标准由四川省饲料工作总站负责起草。 本标准起草人：柏凡李云赵立军张静、林顺全。 DB51/T 11752010 1 饲料中苯乙醇胺 A 的测定 高效液相色谱法 1 范围 本标准规定了饲料中苯乙醇胺A含量的高效液相色谱法检测方法。 本标准适用于配合饲料、预混合饲料和浓缩饲料中苯乙醇胺A的测定。方法最低定量限为2.0mg/kg。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引
3、用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法（GB/ T6682-2008,ISO 3696:1987,MOD） GB/T 20195 动物饲料 试样的制备 3 术语和定义 下列定义适用于本标准。 3.1 苯乙醇胺 A 2-(4-(nitr ophenyl)butan-2-ylamino)-1-(4-methoxyphenyl) ethanol 苯乙醇胺A，俗称克伦巴胺，分子量:344.17 分子式 C 19H24N2O4，2-4-（4-硝基苯基）丁基-2-基氨基-1-甲氧基苯乙醇，
4、英文名称为2-(4-(nitrophenyl)butan-2-ylamino)-1-(4-methox yphenyl) ethanol。化学结构式如下： NONO2CH3OHCH3H4 原理 样品中的苯乙醇胺A以盐酸甲醇溶液提取，提取液经固相萃取柱净化，用高效液相色谱法进行测定，外标法定量。 5 试剂和材料 除方法另有规定外，试剂均为分析纯，实验室用水符合GB/T 6682中一级水的规定。 DB51/T 11752010 2 5.1 乙腈：色谱纯。 5.2 甲醇：分析纯。 5.3 甲酸：优级纯。 5.4 苯乙醇胺 A 对照品：纯度95。 5.5 混合型阳离子固相萃取柱（60 mg/3 mL）
5、，或性能相当者。 5.6 0.1甲酸溶液：取甲酸 1.0mL 加水定容至 1000 mL，摇匀，即得。 5.7 盐酸-甲醇溶液：取 0.1moL/L 盐酸 8 0mL，加入甲醇（5.2）20 mL，摇匀，即得。 5.8 稀释液：20%乙腈水溶液。 5.9 氨化甲醇溶液：取氨水 5mL，加入甲醇（5.2）至 100 mL，混匀。 5.10 饱和醋酸铅溶液：在 50mL 水中加入一定量的醋酸铅，超声 5min，直至固体不再溶解。 5.11 标准储备溶液：100 g/mL，准确称取苯乙醇胺 A，用甲醇配制成 100 g/mL 的标准贮备液，-18避光保存备用，有效期为三个月。 5.12 标准工作溶液
6、：根据需要，临用时用稀释液（5.8）稀释标准储备溶液（5.11），配制成浓度范围为 1.0 g/mL20 g/mL 的标准工作溶液。 6 仪器和设备 6.1 实验室用样品粉碎机。 6.2 电子天平：感量 0.0001g、感量 0.001g。 6.3 离心机：可达 5000r/min(相对离心力为 2988g)。 6.4 固相萃取装置。 6.5 高效液相色谱仪：配紫外检测器。 6.6 氮吹装置。 6.7 有机滤膜：0.45 m。 6.8 振荡器。 7 试样制备 采样按照GB/T 20195 制备样品，全部通过0.28 mm孔筛，混匀，装入密闭容器中，避光低温保存，备用。 8 操作方法 8.1 试
7、样提取 DB51/T 11752010 3 称取试样2 g（精确到0.001 g），置于50 mL离心管中，准确加入盐酸甲醇溶液（5.7）19 mL和1mL饱和醋酸铅溶液（5.10），充分摇动30 s，充分振荡20 min ，然后于离心机上5000 r/min离心10 min，上清液备用。 8.2 试样净化 固相萃取柱(5.5)分别用3 mL甲醇和3 mL水活化，准确移取5 mL上清液（8.1）过柱，分别用2mL水、2mL50%甲醇水溶液淋洗，近干后用5mL氨化甲醇（5.9）溶液洗脱，收集洗脱液。在50水浴中氮气吹干，准确加入1.0 mL稀释液(5.8)溶解，过0.45 m 微孔滤膜，供高效液
8、相色谱测定。当分析物浓度不在线性范围内时，应将分析物稀释或者浓缩后再进行检测。 8.2.1 液相色谱参考条件 色谱柱：C 18柱，柱长150 mm，柱内径4.6 mm，粒度5 m或相当性能类似的分析柱； 柱温：30 ； 流动相：0.1甲酸溶液: 乙腈, 梯度洗脱，梯度见表1； 流速：1.0 mL/min； 进样量：20 L； 检测波长：276nm 表1 梯度洗脱条件 时间（min） 0.1%甲酸溶液() 乙腈() 2 90 10 20 40 60 20.01 90 10 25 90 10 8.2.2 定量测定 按照上述液相色谱条件测定样品和标准工作溶液，以色谱峰面积进行单点或多点校正定量，样品
9、溶液中待测物的响应值应在仪器测定的线性范围内。 9 结果计算 9.1.1 饲料中苯乙醇胺 A 的含量 X，以毫克每千克（mg/kg）表示，单点校正按公式（1）计算： (1) 式中： P 试样溶液峰面积值； Cs 标准溶液浓度，单位为微克每毫升（ g/mL）； Vs 标准溶液进样体积，单位为微升（ L）； Ps 标准溶液峰面积值； DB51/T 11752010 4 m 称取饲料的质量，单位为克（g ）； Vi 试样溶液进样体积，单位为微升（ L）； n 稀释倍数。 多点校正按公式（2 ）计算： (2) 式中： Cx 标准曲线上查得的试样中苯乙醇胺A 的浓度，单位为微克每毫升（ g/mL）； m 称取饲料的质量，单位为克（g ）； n 稀释倍数。 9.1.2 按平行测定的算数平均值报告结果，计算结果保留 3 位有效数字。 10 重复性 同一分析者对同一试样同时两次平行测定结果的相对偏差不大于20%。 DB51/T 11752010 5 AA 附 录 A （资料性附录） 色谱图 图 A.1 苯乙醇胺A 标准溶液10 g/mL的色谱图 _
