1、 ICS DB51备案号：28171-2010 四川省地方标准DB51/T 10812010饲料中赭曲霉毒素 A 的测定 高效液相色谱法 Determination of ochratoxin A in feeds High-performance liquid chromatography 2010-06-01 发布 2010-07-01 实施四川省质量技术监督局发布DB51/T 1081-2010 I 目 次 前 言II 1 范围1 2 规范性引用文件1 3 原理1 4 试剂和溶液1 5 仪器与设备2 6 试样制备2 7 分析步骤2 8 结果计算2 9 精密度3 附录 A 4 DB51/T
2、 1081-2010 II 前 言 本标准的附录A 为资料性附录。 本标准由四川省畜牧食品局提出并归口。 本标准由四川省质量技术监督局批准。 本标准由四川省饲料工作总站负责起草。 本标准起草人：柏凡、赵立军、李云、高庆军、甄阳光、张静。DB51/T 1081-2010 1 饲料中赭曲霉毒素 A 的测定 高效液相色谱法 1 范围 本标准规定了测定饲料中赭曲霉毒素A 的含量的高效液相色谱法(HPLC) 。 本标准适用于配合饲料、浓缩饲料及饲料原料的测定。 本标准中赭曲霉毒素A 的检出限为30 g/kg。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本
3、适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T14699.1 饲料 采样 GB/T20195 动物饲料 试样的制备 3 原理 试样经甲醇-水提取，离心、过滤后，取滤液经过免疫亲和柱净化，浓缩，用高效液相色谱仪-荧光检测器检测，外标法计算赭曲霉毒素A的含量。 4 试剂和溶液 除特殊说明外，所有试剂均为分析纯，色谱用水符合GB/T6682 一级用水的规定。 4.1 甲醇：分析纯、色谱纯。 4.2 氯化钠。 4.3 氯化钾。 4.4 磷酸钠。 4.5 磷酸氢二钠。 4.6 磷酸二氢钾。 4.7 提取液：甲醇
4、+ 水=80+20（体积比）。 4.8 吐温-20 。 4.9 磷酸盐缓冲液（PBS ）：称取 8.0g 氯化钠、 1.44g 磷酸氢二钠、 0.2g 磷酸二氢钾、 0.2g 氯化钾，溶于 1000mL 水，用盐酸或氢氧化钠溶液调 pH 至 7.0。 4.10 清洗缓冲液：0.1mL 吐温-20 溶于 1LPBS（4.9）缓冲液中。 4.11 赭曲霉毒素 A 标准品：含量大于 98%。 4.11.1 标准贮备液：精密称取 10mg 赭曲霉毒素 A 标准品，用乙腈溶解、定容至 100 mL，此贮备液浓度为 100 g/mL，置于冰箱中 28 保存，有效期 6 个月。 4.11.2 标准工作溶液：
5、分别准确移取赭曲霉毒素 A 贮备液，用流动相配制成标准工作溶液：0.001 g/mL， 0.01 g/mL， 0.1g/mL， 0.5g/mL， 1.0 g/mL， 5.0 g/mL。置于冰箱中 28 保存，有效期1 个月。 注意： 注1:凡接触赭曲霉毒素A的容器，需浸入4%次氯酸钠（NaOCl ）溶液，放置半天后清洗备用。 注2:为了安全，分析人员操作时须带上医用乳胶手套，在通风橱内操作。 DB51/T 1081-2010 2 4.11.3 赭曲霉毒素免疫亲和柱。 5 仪器与设备 5.1 分析天平：感量 0.1 mg。 5.2 超声波清洗器。 5.3 离心机：转速为 5000 r/min 以
6、上。 5.4 超纯水处理器。 5.5 涡旋混合器。 5.6 高效液相色谱仪：配备荧光检测器。 5.7 氮吹仪。 5.8 0.45 m 滤膜。 6 试样制备 按GB/T14699.1规定采集试样后，按GB/T20195 规定，选取具有代表性的实验室样品1kg ，四分法缩减分取200g 左右，粉碎过1mm 孔筛，混匀装入磨口瓶中备用。 7 分析步骤 7.1 试样溶液的制备 7.1.1 提取 称取 20g 试样 (精确至 0.01g)于锥形瓶中，加入 2g 氯化钠（4.2 ），50mL 提取液（ 4.7），超声提取20min，离心，取上清液过滤，准确量取滤液 5.0mL，加入 20mLPBS（4.9
7、）稀释，混匀，待净化。 7.1.2 净化 将免疫亲和柱底帽除去。剪去亲和柱的盖帽，与10ml 注射器连接。待免疫亲和柱中缓冲液排出后，精确吸取上述稀释液5.0mL过免疫亲和柱（流速 1-2滴 /秒），再依次用5 mL清洗缓冲液（4.10）、 5mL蒸馏水淋洗柱子，抽干柱子，用2.0mL 甲醇洗脱，收集洗脱液于50 水浴中氮气吹干，准确加入流动相1000L，涡旋30s ，过0.45m 滤膜，上机测定。 7.2 色谱条件 7.2.1 色谱柱：C18柱，柱长 250mm，内径 4.6mm，粒度 5m；或性能相当的色谱柱。 7.2.2 柱温：30。 7.2.3 流动相：甲醇 + 水（1% 乙酸）50+
8、50（体积比）。 7.2.4 流速：1.0mL/min 。 7.2.5 检测器：荧光检测器，Ex ：330nm ， Em：460nm 。 7.2.6 进样量：50 L。 7.3 测定 按上述色谱条件，分别将标准溶液和试样溶液上机测定，按照保留时间进行定性，单点或多点校正，外标法定量。当分析物浓度不在线性范围内时，应将分析物稀释或者浓缩后再进行检测。 8 结果计算 试样中赭曲霉毒素 A 的含量 X，以质量分数毫克每千克(mg/kg) 表示，单点校正按式(1) 计算： nmAsVCsAX = (1) 式中： V上机定容体积，单位为毫升(mL) ； DB51/T 1081-2010 3 As赭曲霉毒素A 标准溶液对应的色谱峰面积响应值； A试样溶液对应的色谱峰面积响应值； Cs赭曲霉毒素A 标准溶液的浓度，单位为微克每毫升( g/mL)； m试样质量，单位为克(g) ； n稀释倍数。 结果用平行测定的算术平均值表示，保留三位有效数字。 9 精密度 在重复性试验条件下两次平行测定结果的相对偏差不大于10% 。 DB51/T 1081-2010 4 附 录 A （资料性附录） 赭曲霉毒素 A 标准色谱图 图A.1 赭曲霉毒素A标准色谱图 _
