1、 ICS DB51备案号：28168-2010 四川省地方标准DB51/T 10782010饲料中 T-2 毒素的测定 高效液相色谱法 Determination of T-2 toxin in feeds High performance liquid chromatography 2010-06-01 发布 2010-07-01 实施四川省质量技术监督局发布DB51/T 1078-2010 I 目 次 前言 II 1 范围 1 2 规范性引用文件 1 3 原理 1 4 试剂和溶液 1 5 仪器与设备 1 6 试样制备 . . 2 7 分析步骤 . . 2 8 结果计算 . . 2 9 精密
2、度 3 附录 A（资料 性附录） 4 DB51/T 1078-2010 II 前 言 本标准的附录A 为资料性附录。 本标准由四川省畜牧食品局提出并归口。 本标准由四川省质量技术监督局批准。 本标准由四川省饲料工作总站负责起草。 本标准起草人：柏凡、李云、魏敏、王宇萍、张静、赵立军。DB51/T 1078-2010 1 饲料中 T-2 毒素的测定 高效液相色谱法 1 范围 本标准规定了测饲料中T-2 毒素的含量的高效液相色谱法(HPLC) 。 本标准适用于配合饲料、浓缩饲料及饲料原料的测定。 本标准中检出限为0.1 mg/kg。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注
3、日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T14699.1 饲料 采样 GB/T20195 动物饲料 试样的制备 3 原理 试样经甲醇- 水提取，提取液经过免疫亲和柱净化，浓缩，衍生后，用高效液相色谱仪- 荧光检测器检测，外标法计算T-2 毒素含量。 4 试剂和溶液 除特殊说明外，所有试剂均为分析纯，色谱用水符合GB/T6682 一级用水的规定。 4.1 乙腈：色谱纯。 4.2 甲醇：色谱纯。 4.3 甲苯：色谱级。 4.4 甲醇- 水（8+2）提取液：取 80 mL
4、甲醇，加 20 mL 水，混匀。 4.5 4-二甲基氨基吡啶（DMAP ）溶液：准确称取 0.0325 g 于 100 mL 容量瓶中，用甲苯稀释至刻度。 4.6 1-氰酸蒽（1-AN ）溶液：准确称取 0.030 g 于 100 mL 容量瓶中，用甲苯稀释至刻度。 4.7 T-2 毒素标准品：含量大于 98%。 4.7.1 标准贮备液：精密称取 10 mgT-2 毒素标准品，用乙腈溶解、定容至 100 mL，此贮备液浓度为100 g/mL，置于冰箱中-20 保存，有效期 6 个月。 4.7.2 标准工作溶液：分别准确移取 T-2 毒素贮备液，用乙腈配制成标准工作溶液： 0.05 g/mL 、
5、 0.10 g/mL 、0.50 g/mL、1.00 g/mL、2.00 g/mL，5.00 g/mL，置于冰箱中 2 8保存，有效期 1 个月。 注意 ： 注1:凡接触T-2毒素的容器，需浸入4%次氯酸钠（NaOCl ）溶液，放置半天后清洗备用。 注2:为了安全，分析人员操作时须带上医用乳胶手套，在通风橱内操作。 4.8 T-2 毒素免疫亲和柱。 5 仪器与设备 5.1 分析天平：感量 0.1 mg。 5.2 超声波清洗器。 5.3 离心机：转速为 5000 r/min 以上。 5.4 超纯水处理器。 DB51/T 1078-2010 2 5.5 涡旋混合器。 5.6 高效液相色谱仪：配备荧
6、光外检测器。 5.7 氮吹仪。 5.8 0.45 m 滤膜。 6 试样制备 按 GB/T14699.1规定采集试样后，按GB/T20195 规定，选取具有代表性的实验室样品1 kg ，四分法缩减分取200 g 左右，粉碎过1 mm 孔筛，混匀装入磨口瓶中备用。 7 分析步骤 7.1 试样溶液的制备 7.1.1 提取 称取 25 g 试样 (精确至 0.01 g)于锥形瓶中，加入 100 mL 甲醇- 水（ 8+2）提取液（4.4），超声提取20 min，离心，取上清液过滤，移取 10.0 mL 滤液，加入 40.0 mL 水稀释混匀，待净化。 7.1.2 净化 将免疫亲和柱连接于20 mL 注
7、射器下，准确吸取10.0 mL 提取液以1 mL/min 的速度通过免疫亲和柱，用10 mL 水淋洗，抽干柱子，用2 mL 甲醇（4.2）洗脱。洗脱液50氮气吹干，待衍生。 7.1.3 衍生 于净化吹干的样品中，分别加入50 L4- 二甲基氨基吡啶（DMAP ）溶液（4.6）和 50 L1-氰酸蒽（1-AN ）溶液（4.6），涡旋混合1 min，于 50水浴中反应15 min ，在冰水中冷却10 min 。 50以下氮气吹干后，准确加入流动相（7.2.3 ）1.0mL ，涡旋30 s ，过 0.45 m滤膜，上机测定。 7.2 色谱条件 7.2.1 色谱柱：C18柱，柱长 250 mm，内径
8、4.6 mm，粒度 5 m；或性能相当的色谱柱。 7.2.2 柱温：30。 7.2.3 流动相：乙腈+ 水80+20（体积比）。 7.2.4 流速：1.0 mL/min 。 7.2.5 检测器：荧光检测器，Ex ： 381 nm，Em ：470 nm 。 7.2.6 进样量：40 L。 7.3 测定 按上述色谱条件，分别将标准溶液和试样溶液上机测定，按照保留时间进行定性，单点或多点校正外标法定量。 8 结果计算 试样中 T-2 毒素的含量 X，以质量分数毫克每千克(mg/kg) 表示，单点校正按式(1) 计算： nmAsVCsAX = (1) 式中： V上机定容体积，单位为毫升(mL) ； AsT-2毒素标准溶液对应的色谱峰面积； A试样溶液对应的色谱峰面积； CsT-2毒素标准溶液的浓度，单位为微克每毫升( g/mL)； m试样质量，单位为克(g) ； n稀释倍数。 结果用平行测定的算术平均值表示，保留三位有效数字。 DB51/T 1078-2010 3 9 精密度 在重复性试验条件下两次平行测定结果的相对偏差不大于10% 。 DB51/T 1078-2010 4 附 录 A （资料性附录） T-2毒素标准图谱 图A.1 T-2 毒素标准色谱图 _
