1、 ICS DB51备案号：28167-2010 四川省地方标准DB51/T 10772010饲料中黄曲霉毒素 B 、 B 、 G 、 G 的测定1 2 1 2高效液相色谱法 Determination of aflatoxins BB1、B2、 G 、GB1 2in feeds High performance liquid chromatography 2010-06-01 发布 2010-07-01 实施四川省质量技术监督局发布DB51/T 1077-2010 I 目 次 前言 II 1 范围 1 2 规范性引用文件 1 3 原理 1 4 试剂和溶液 1 5 仪器与设备 1 6 试样制备
2、. . 2 7 分析步骤 . . 2 8 结果计算 . . 2 9 精密度 3 附录 A（资料 性附录） 4 DB51/T 1077-2010 II 前 言 本标准的附录A 为资料性附录。 本标准由四川省畜牧食品局提出并归口。 本标准由四川省质量技术监督局批准。 本标准由四川省饲料工作总站负责起草。 本标准起草人：柏凡、张静、李云、冯娅、甄阳光、赵立军。DB51/T 1077-2010 1 饲料中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的测定 高效液相色谱法 1 范围 本标准规定了测饲料中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的含量的高效液相色谱法(HPLC) 。 本标准适用于配合饲料、浓缩饲料及饲料原料的
3、测定。 本标准中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的检出限分别为2.0 g/kg、0.8 g/kg、2.5 g/kg、1.5 g/kg。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T14699.1 饲料 采样 GB/T20195 动物饲料 试样的制备 3 原理 试样经乙腈-水提取，离心、过滤后，取滤液经过免疫亲和柱净化，浓缩，用高效液相色谱仪-柱后衍生-荧光检测器检测，外标法计算黄曲霉毒素B 1、B 2、G
4、1、G 2含量。 4 试剂和溶液 除特殊说明外，所有试剂均为分析纯，色谱用水符合GB/T6682 一级用水的规定。 4.1 甲醇：分析纯、色谱纯。 4.2 氯化钠。 4.3 氯化钾。 4.4 磷酸氢二钠。 4.5 磷酸二氢钾。 4.6 甲醇- 水（70+30）提取液：量取甲醇 700 mL，加水 300 mL，混匀。 4.7 磷酸盐缓冲液（PBS ）：称取 8.0 g 氯化钠、1.44 g 磷酸氢二钠、0.2 g 磷酸二氢钾、0.2 g 氯化钾，溶于 1000 mL 水，用盐酸或氢氧化钠溶液调 pH7.4。 4.8 黄曲霉毒素混合标准溶液：B1、G1为 2.0 g/mL，B2、G2为 0.5
5、g/mL。 4.8.1 标准贮备液：精密量取 1.0 mL黄曲霉毒素混合标准溶液，用乙腈溶解、定容至 10 mL，此贮备液黄曲霉毒素B1、 B2、 G1、 G2浓度分别为 200 g/L、 50 g/L、 200 g/L、 50 g/L，置于冰箱中 28 保存，有效期 6 个月。 4.8.2 标准工作溶液：分别准确移取标准贮备液，用流动相配制成标准工作溶液，黄曲霉毒素B1、G1的浓度为 1.0 g/L、 2.0 g/L、 5.0 g/L、 10.0 g/L、 20.0 g/L、 50.0 g/L，黄曲霉毒素B2、 G2的浓度为0.25 g/L、 0.50 g/L、 1.25 g/L、2.50
6、g/L、 5.00 g/L、 12.50 g/L，置于冰箱中 28 保存，有效期 1 个月。 注意： 注1:凡接触黄曲霉毒素的容器，需浸入4%次氯酸钠（NaOCl ）溶液，放置半天后清洗备用。 注2:为了安全，分析人员操作时须带上医用乳胶手套，在通风橱内操作。 4.9 黄曲霉毒素免疫亲和柱。 5 仪器与设备 DB51/T 1077-2010 2 5.1 分析天平：感量 0.1 mg。 5.2 振荡器。 5.3 离心机：转速为 5000 r/min 以上。 5.4 超纯水处理器。 5.5 涡旋混合器。 5.6 高效液相色谱仪：配备荧光检测器。 5.7 柱后光化学衍生器。 5.8 氮吹仪。 5.9
7、 0.45 m 滤膜。 6 试样制备 按 GB/T14699.1规定采集试样后，按GB/T20195 规定，选取具有代表性的实验室样品1 kg ，四分法缩减分取200 g 左右，粉碎过1 mm 孔筛，混匀装入磨口瓶中备用。 7 分析步骤 7.1 试样溶液的制备 7.1.1 提取 称取 25 g 试样 (精确至 0.01 g)于锥形瓶中，加入 125 mL 甲醇- 水（ 70+30）提取液（4.6），振荡提取 40 min，离心，取上清液过滤，准确量取滤液 10 mL，加入 30 mLPBS（4.7）稀释，混匀，待净化。 7.1.2 净化 取10 mLPBS 活化小柱，将上述10 mL 提取液以
8、1-2 滴/ 秒的速度通过免疫亲和柱，用10 mLPBS （4.7）水淋洗，抽干柱子，用1 mL 甲醇（4.1）洗脱。洗脱液6 0氮气吹干，准确加入流动相（7.2.3 ） 1.0 mL，涡旋30s ，过 0.45 m滤膜，上机测定。 7.2 色谱条件 7.2.1 色谱柱：C18柱，柱长 250 mm，内径 4.6 mm，粒度 5 m；或性能相当的色谱柱。 7.2.2 柱温：30。 7.2.3 流动相：甲醇+ 水45+55（体积比）。 7.2.4 流速：1.0 mL/min 。 7.2.5 检测器：荧光检测器，Ex ：370 nm ， Em：450 nm 。 7.2.6 进样量：50 L。 7.
9、3 测定 按上述色谱条件，分别将标准溶液和试样溶液上级测定，按照保留时间进行定性，单点或多点校正外标法定量。 8 结果计算 试样中黄曲霉毒素B1、 B2、 G1、 G2的含量X，以质量分数微克每千克( g/kg)表示，单点校正按式(1)计算： nmAsVCsAX = (1) 式中： V上机定容体积，单位为毫升(mL) ； As黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2标准溶液对应的色谱峰面积； A试样溶液对应的色谱峰面积； Cs黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2标准工作溶液的浓度，单位为微克每升( g/L)； DB51/T 1077-2010 3 m试样质量，单位为克(g) ； n稀释倍数。 结果用平行测定的算术平均值表示，保留三位有效数字。 9 精密度 在重复性试验条件下两次平行测定结果的相对偏差不大于10% 。 DB51/T 1077-2010 4 附 录 A （资料性附录） 黄曲霉毒素B 1、B 2、G 1、G 2标准图谱 图A.1 黄曲霉毒素B 1、B 2、G 1、G 2标准色谱图 _
