1、 DB36备案号：18620-2006 江西省地方标准 DB36/T 4852005 猪尿中沙丁胺醇的测定-酶联免疫吸附法2005-12-25 发布 2006-02-01实施 江西省质量技术监督局发布DB36/T 4852005 I 前 言 本标准由江西省农业厅提出。 本标准起草单位：江西省兽药饲料监察所。 本标准主要起草人：徐国茂、周伟良、万文根、姜文娟、刘安南、陈文云、胡翊炜。DB36/T 4852005 1 猪尿中沙丁胺醇的测定-酶联免疫吸附法 1 范围 本标准规定了猪尿中沙丁胺醇酶联免疫吸附测定方法。 本标准适用于猪尿中沙丁胺醇残留快速筛选检测。 2 方法原理 测定的基础是抗原抗体反应
2、。微孔板包被有针对沙丁胺醇的兔抗体。经过洗涤步骤后，加入沙丁胺 醇酶标记物、标准或样品溶液。沙丁胺醇与沙丁胺醇酶标记物竞争抗体，没有连接的沙丁胺醇酶标记物 在洗涤步骤中被 除去。将酶反应底物(过氧化尿素)和显色剂(四甲基联苯胺)加入到孔中并且孵育。结 合的酶标记物将无色的显色剂转化为蓝色的产物。加入反应停止液后使颜色由蓝转变为黄色。在450nm 处测量 ，吸收光强度与样品中的沙丁胺醇浓度成反比。 3 试剂与材料 以下试剂除特别注明外均为分析纯，水为蒸馏水。 3.1 微孔板酶标仪(450nm) 3.2 离心机(2500rpm 以上) 3.3 微量加样器(20L、50L、100L、200L、250
3、L) 3.4 酶标板 3.5 沙丁胺醇酶标记物 3.6 沙丁胺醇标准液(0、0.1 ng/L、0.3 ng/L、 0.9 ng/L、 2.7 ng/L、 8.1ng/L) 3.7 酶反应底物(含有过氧化尿素) 3.8 显色剂(四甲基苯胺) 3.9 磷酸缓冲液(PBS) 3.10 洗液(PBST) 3.11 反应停止液(1mol/L 盐酸) 4 制样 取10mL尿样以2500rpm离心10分钟后取上清部分(清亮部分)用于检测。若尿样呈浑浊状，需先用滤 纸过滤，再取10mL尿样以2500rpm离心10分钟后取上清部分(清亮部分)用于检测。 5 测定 5.1 测定之前将所有试剂及供试样品回温到 20
4、25。 5.2 测定程序(2025) 5.2.1 将足够标准和样品所用数量的孔条插入微孔架，标准和样品做两个平行实验，记录下标准和样 品的位置。倒出孔中的抗体液，用 PBST 液洗涤三次。每次洗板应加入洗液后 2 分钟再倒掉。 5.2.2 加入 50L 的标准液或处理好的样品液到各自的微孔中。 5.2.3 加入 100L 稀释的酶标记物到微孔底部，2530孵育 30 分钟上。 DB36/T 4852005 2 5.2.4 倒出孔中的液体，将微孔架倒置在吸水纸上拍打(每行拍打 3 次)完全除去孔中的液体，用 250 L 稀释后的 PBST 充入孔中，再次倒掉微孔中液体，再重复操作两次。每次洗板应
5、加入洗液后等 2 分 钟再倒掉。 5.2.5 反应底物与显色剂以 11 混合后加入 100L 到微孔中， 充分混合并在 2025暗处孵育 15 分钟。 5.2.6 加入 50L 反应停止液到微孔中，混合好在 450 nm 处测量吸光度值，应在加入停止液后 10 分 钟内读取读取吸光度值。 5.3 结果判定和表述 按下式计算百分吸光度值： 百分吸光度值=B/BO100% 式中：B-为标准溶液或供试样品的平均吸光度；B0-零标准的标准溶液平均吸光度值； 以X轴为标准溶液中沙丁胺醇浓度(ng/L)的自然对数，Y轴为百分吸光度值，在半对数坐标纸上绘制 标准曲线图。从标准曲线上查出供试样品中沙丁胺醇的浓度(ng/L)。也可以用专业计算机软件求出供试 样品中沙丁胺醇的浓度。 检测结果小于1000ng/L时判为未检出；大于或等于1000ng/L时为可疑阳性，需要用确证法复检，复 检后小于或等于1000ng/L为未检出，大于1000ng/L为阳性。 6 检测方法灵敏度、准确度、精密度 6.1 灵敏度 本方法在猪尿中的检测限为1000ng/L。 6.2 准确度 本方法在1000ng/L添加浓度回收率为60120。 6.3 精密度 本方法的批内变异系数CV30%,批间变异系数为CV45。 7 其他 7.1 试剂盒应放在 28冰箱内保存。 7.2 操作时要戴上医用乳胶手套。 _
