1、 DB36备案号： 13617-2003 江西省地方标准DB36/T 4112003猪肝中克伦特罗检测方法 -酶联免疫吸附测定法 2003-05-19 发布 2003-05-19 实施江西省质量技术监督局发布DB36/T 4112003 I 目 次 前言 . II 1 范围 1 2 测定方法 1 3 制样 2 DB36/T 4112003 II 前 言 克伦特罗为-肾上腺素受体激动药，是一种用于人治疗哮喘、支气管痉挛的药物。研究发现在饲料中添加克伦特罗可促进生长、提高瘦肉率，特别是改进脂肪型动物的肉与脂肪的比例，猪饲用后生长速度快，体型好，且瘦肉多、脂肪少，被当作“瘦肉精”而成为一些饲料生产企
2、业和养猪户的“秘密武器”。但是克伦特罗进入猪体内后，主要分布在肝等内脏器官，在体内代谢的时间较长，容易造成药物在组织中残留，给消费者带来危害；健康的人在食用一定量的残留有克伦特罗的猪肉或内脏后，可能出现肌肉震颤、心慌、战栗、恶心、代谢紊乱 、呼吸急促、烦躁不安等症状。由于克伦特罗的性质稳定，非常有可能残留在猪肝等脏器及组织中，因此制订猪肝中克伦特罗的检测方法，以监测“瘦肉精”的使用，显得非常重要。 竟争酶标免疫法是非常有效的筛选方法，可定量测定尿、肌肉、肝脏及牛眼中的克伦特罗。此法快速简便、经济实用，较易掌握推广。 本标准由江西省农业厅提出。 本标准由江西省兽药饲料监察所负责起草。 本标准起草
3、人：刘安南、万文根、陈文云、徐国茂。 DB36/T 4112003 1 猪肝中克伦特罗检测方法 -酶联免疫吸附测定法 1 范围 本标准规定了猪肝中克伦特罗检验的制样和酶联免疫吸附测定方法。 本标准适用于猪肝中克伦特罗的残留常规快速筛选及定量检测。 2 测定方法 2.1 原理与方法 测定的基础是抗原抗体反应。酶联板包被有克伦特罗特异性抗体的抗体，加入抗克伦特罗的特异性抗体，两者结合被固定。标样或试样中克伦特罗与酶（辣根过氧化物酶）标记抗原竞争抗克伦特罗的特异性抗体。通过洗涤以除去没有与抗克伦特罗的特异性抗体结合的酶标记抗原。加入酶基质（过氧化尿素）和发色剂（四甲基联苯胺）结合到酶联板上的酶标记物
4、将无色的发色剂转化为蓝色的产物。加入反应停止液后使颜色由蓝色转变为黄色。在450nm 处测定吸光度值。吸光度值与样品中的克伦特罗浓度成反比。 2.2 试剂、用途及仪器、设备 需自备的试剂、设备。 2.2.1 50mmol/L 盐酸 2.2.2 1mol/L 氢氧化钠 2.2.3 50mmol/L 磷酸二氢钾缓冲液 pH3.0 2.2.4 500mmol/L 磷酸二氢钾缓冲液 pH3.0 2.2.5 甲醇：分析纯 2.2.6 分析天平 2.2.7 匀浆机 2.2.8 固相萃取装置 2.2.9 微孔板酶标仪（450nm） 2.2.10 离心机 2.2.11 微型振荡器 2.2.12 微量加样器（2
5、0l,50l,100l,200l,250l） 2.2.13 C18柱 竟争酶标免疫法试剂盒可用于定量测定尿、肌肉、肝脏等中的克伦特罗。试剂盒中包括了预处理完成后检测用的试剂。 2.2.14 克伦特罗系列标准溶液(0ng/L,100ng/L,300ng/L,900ng/L,2700ng/L,8100ng/L) 2.2.15 酶标板 2.2.16 抗克伦特罗的特异性抗体 2.2.17 酶标记抗原 2.2.18 缓冲溶液 2.2.19 酶基质/发色剂 2.2.20 反应停止液（1mol/L 硫酸） DB36/T 4112003 2 3 制样 3.1 样品的制备 3.1.1 将猪肝样品解冻，剪碎，置于
6、匀浆机中高速捣碎，取 5g 匀浆的猪肝样品与 25ml 50mmol/L 盐酸混合，振荡 1.5h 均质。 3.1.2 称 6g 均质物（相当于 1g 肝脏），加入离心瓶中,在 1015,至少 4000g 离心 15min。 3.1.3 转移上清液到另一个离心瓶中，加 300l 1mol/LNaoH3. 2.2混合 15min，加入 4ml 500mmol/L磷酸二氢钾缓冲液 pH3.03.2.4，简单地混合，并在 4 保存至少 1.5h 或过夜。 3.1.4 再在 1015,至少 4000g离心 15min，分离全部上清液（应该是清亮的，非常重要），使其升至室温（2024），然后用C 18柱
7、纯化。 3.2 C18柱纯化步骤 所有试剂和样品提取液在过柱纯化前应达到室温（2024），纯化过程中严格控制过柱时的流速。 3.2.1 用 3ml 甲醇3.2.5洗涤柱子，流速为每秒 1 滴。 3.2.2 用 2ml 洗涤液3.2.3 洗涤柱子。 3.2.3 样品进柱（分离的全部上清液）。 3.2.4 用 2ml 洗涤液3.2.3洗涤柱子。 3.2.5 用正压去除残留的流体并且用空气或氮气吹 2min 干燥柱子。 3.2.6 用 1ml 甲醇3.2.5洗脱样品，流速为每分钟 15 滴。 3.2.7 5060下用弱空气或氮气流将洗脱液完全蒸干。 3.2.8 用 1ml 双蒸水溶解干燥的残留物，取
8、 20l 进行分析。 3.3 样品的保存 3.3.1 未处理的样品冷冻保存。 3.3.2 盐酸均质后的样品 28可保存 3d。 3.3.3 以磷酸二氢钾缓冲液提取后的样品（C 18柱纯化之前）28可保存 2d，使用前离心。 3.3.4 C18柱纯化步骤（即 4.2.6）所获得的甲醇洗脱物冷冻可以保存数周，28可保存 2 周。 3.3.5 用双蒸水溶解的干燥残留物（即 4.2.8）28可保存 1 周。 3.4 测定 测定之前将所有试剂回升至室温2024，供试样品取其上清液。 3.4.1 测定程序 （室温 204条件下操作） （1） 将足够标准和样品所用数量的孔条插入微孔架，标准和样品做两个平行实
9、验，记录下标准和样品的位置。 （2）加入 100l 稀释后的抗体溶液到每一个微孔中底部，在室温孵育 15min。 （3）倒出孔中的液体，将微孔架倒置在吸水纸上拍打（每行拍打 3 次）以保证完全除去孔中的液体，用 250l 蒸馏水充入孔中，再次倒掉微孔中液体，重复操作两遍以上。 （4）精密吸取 20l 标准溶液3.2.14及处理好的样品到各自的微孔中，标准和样品做两个平行实验。 （5）加入 100l 稀释的酶标记物到微孔底部，在微型震荡器上混匀，室温孵育 30min。 （6）重复步骤（3）。 （7）加入 100l 基质/发色试剂到微孔中，在微量振荡器上充分混匀(或小心地在平面上转动酶标板以充分混
10、合)，并在室温暗处孵育 15min。 （8）加入 100l 反应停止液到微孔中，混匀。在 60min 内 450nm 处以空气为空白测定吸光度值。 3.4.2 结果判定和表述 按下式计算百分吸光度值： 百分吸光度值B/B 0 100% DB36/T 4112003 3 式中： B为标准溶液或供试样品的平均吸光度值； B0为零标准的标准溶液平均吸光度值。 以X轴为标准溶液中克伦特罗浓度（ng/L）的自然对数，Y轴为百分吸光度值，在半对数坐标纸上绘制标准曲线图。从标准曲线上查出供试样品中克伦特罗的浓度（ng/L）。也可以用专业计算机软件求出供试样品中克伦特罗的浓度。 检测结果小于1000ng/kg时判为未检出，大于或等于100 0ng/kg时判为可疑，需要复检后再确定。复检后小于或等于1000ng/kg为未检出，大于1000ng/kg为阳性。猪肝稀释系数为1。 _
