1、 ICS 备案号： 辽 宁 省 地 方 标 准 DB21 DB21/T 1652 2008 鸡新城疫免 疫监测技术规范 Technical specifications for Newcastle Disease antibodies detection 2008-09-27 发布 2008-10-01 实施 辽宁省质量技术监督局 发布 DB21/T 1652 2008 I 前 言 本标准由辽宁省动物卫生监督管理局提出。 本标准由辽宁省质量技术监督局归口。 本标准按 GB/T1.1-2000 标准的结构和编写规则 的编写要求。 本标准起草单位：辽宁省畜牧兽医科学研究所 辽宁省动物疫病预防控制中
2、心。 本标准主要起草人：姜新、崔玉君、王春艳、闫明媚、李景春、李清竹、崔基贤、孙士宇。 DB21/T 1652 2008 1 鸡新城疫免疫监测技术规范 1 范围 本规范规定了新城疫的免疫监测标准，适用于各日龄及各种类型养殖场鸡新城疫抗体监测。 2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准 的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB 16550-1996鸡新城疫检疫技术规范 3 原理 鸡新城疫病毒是一种
3、RNA 病毒，属副粘病毒科，具有血凝素和神经氨酸酶活性。由于其血凝素能结合于红细胞表面的受体而凝集红细胞， 简称血凝。若将特异性抗体与 鸡新城疫 病毒 (血凝素 )预先作用后再加入红细胞则不产生凝集，称为血凝抑制 现象。用定量血凝素与不同稀释度血清抗体作用后，能完全抑制血凝的最高稀释度，即为血凝抑制抗体效价。 该免疫监测技术采用全血法。这是一种固定抗体稀释抗原的方法，需要预先将抗原在实验室进行标准化标定，确定起始稀释倍数，倍比稀释后加入固定稀释倍数的被检血清。 神经氨酸酶可将病毒逐渐从红细胞上洗脱下来。因此鸡新城疫病毒凝集红细胞后会缓慢自动洗脱。本规范研制的稀释液加入了指示剂和络合剂。加入指示
4、剂，易于观察试验过程；加入络合剂，使抗原抗体结合更加稳固。 4 试剂和材料 4.1 阿氏 (Alsevers)液的配制 称取葡 萄糖 2.05g、柠檬酸钠 0.8g、柠檬酸 0.055g、氯化钠 0.42g，加蒸馏水至 100mL，加热溶解后调 pH值至 6.1， 69kPa 15min高压灭菌， 4保存备用。 4.2 磷酸盐缓冲液 (pH 7.0-7.2,0.01 mol/L)的配制 氯化钠 170g、 磷酸二氢钾 13. 6g、氢氧化钠 3. 0g,蒸馏水 1 000 m1，高压灭菌， 4保存，使用时作 20倍稀释。 4.3 工作原液的配制 蒸馏水或无离子水 2500ml、柠檬酸钠 500
5、g、葡萄糖 500g、 NaCl425g、氯化铬 5g、叠氮钠 25g，将 柠檬酸钠加热溶解后再加入其它药品，用 NaOH调 pH 至 7.0。 该工作液为专用工作液，可以长期保存使用，使用时用蒸馏水或去离子水稀释 20倍稀释。 4.4 器材 微量移液器， 50ul 定量吸液器；离心管及离心管架， 1.5ml 离心管及离心管架；血凝滴定板 ,采用一次性 96 孔微量血凝滴定板。 5 操作方法 5.1 抗原的标定 5.1.1 1红细胞悬液制备 DB21/T 1652 2008 2 采集至少 3只 SPF公鸡或无禽流感和新城疫等抗体的健康公鸡的血液与等体积阿氏液混合，用pH7.0-7.2,0.01
6、 mo1/l PBS液洗涤 3-5次，每次均 以 1500 1800 r/min 离心 8分钟 ,洗涤后用 PBS配成体积分数为 1%红细胞悬液， 4保存备用。 5.1.2 在微量反应板的 1 孔 12 孔均加入 0.05mL PBS，换滴头。 5.1.3 吸取 0.05mL 抗原加入第 l 孔，混匀。 5.1.4 从第 1 孔吸取 0.05mL 抗原加入第 2 孔，混匀后吸取 0.05mL 加入第 3 孔，如此进行倍比稀释至第 11 孔，从第 11 孔吸取 0.05mL 弃之，换滴头。 5.1.5 每孔均加入 0.05mL 体积分数为 1%鸡红细胞悬液（将鸡红细胞悬液充分摇匀后加入）。 5.
7、1.6 置 微型振荡器（ B1.2）上振荡 1min，或手 动振荡 混匀。 5.1.7 放室温下 30 40min，根据血凝图象判定结果。 能使红细胞完全凝集（ 100%凝集， +）的抗原最高稀释度为该抗原的血凝效价，此效价为 1个血凝单位（ HAU）。注意对照孔应呈现完全不凝集（ -），否则此次检验无效。将抗原 HA效价预先在实验室统一标定为 512倍，即抗原的基础稀释倍数为 512倍。 5.2 全血血凝抑制试验操作步骤 5.2.1 将工作原液 20 倍稀释；抗原按标注量用工作液稀释。 5.2.2 根据被检鸡数将稀释好的工作液移入离 心管中，每管 1ml。 5.2.3 针刺被检鸡翅下静脉，待
8、出血后用微量吸液器吸取 0.05ml（多余血液用棉球擦去），移入装有工作液的离心管内反复抽吸 3 5 次将血液混合后备用。 5.2.4 吸取工作液滴入反应板，每孔 0.05ml。 5.2.5 用微量吸液器吸取 0.05ml 抗原，加入第 1 孔，反复抽吸 3 至 5 次，混合后，取 0.05ml 移入第2 孔，按此方法稀释至第 11 孔后弃掉 0.05ml，第 12 孔不稀释留做对照。 5.2.6 用微量吸液器吸取被检鸡稀释后的血液，从第 12 孔开始，从后往前每孔加入 0.05ml，每加 入一孔必须用微量吸液器反复吸 3 至 5 次，以充分混合。 5.2.7 在室温下反应，至第 12 孔对照
9、组红细胞 100%下沉（不凝集）时开始判定，记录各样本的凝集抑制价。 5.2.8 将板倾斜，观察红细胞有无呈泪滴状流淌。以完全抑制抗原 (流淌 )的血清最高稀释倍数作为 HI滴度。 鸡新城疫免疫监测操作 步骤 表 孔号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 HI 值 1024 512 256 128 64 32 16 8 4 2 1 对照 工作液 标准抗原 被检血液 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0 弃去 0.05 置室温下反应至对照组完全沉降开始判定 试验结果（ 2n） 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 对照 6 结果判定 在对照出现正确结果的 情况下，从 11 孔开始由后向前依次为 0log2 10log2，计算抗体滴度，以完全抑制红细胞凝集的最大稀释度为该血清的血凝抑制滴度。 免疫 21天抗体效价 2 5为免疫合格。
