1、 辽宁省地 方 标 准 DB21 DB21/T 1648 2008 牛胚胎移植技术操作规程 The Technological Rules of Cattle Embryo Transfer 2008-09-27 发布 2008-10-01 实施 辽宁省质量技术监督局 发布 DB21/T 1648 2008 I 前 言 本标准用于指导和规范牛胚胎移植技术操作。 本标准的附录 A为规范性附录，附录 B为资料性附录。 本标准由辽宁省质量技术监督局提出并归口。 本标准由辽宁省畜牧业经济管理站负责起草。 本标准主要起草人：何永涛、李波、周晨阳、张丽君、金双勇、王启驷、张广文、李长春、杨奎林、闫雪松。
2、DB21/T 1648 2008 1 牛胚胎移植技术操作规程 1 范围 本标准规定了奶牛和肉牛胚胎移植技术的超数排卵、采胚、检胚、胚胎质量鉴定、胚胎冷冻及解冻、胚胎移植以及妊娠诊断各关键技术环节的操作方法。 本标准适用于奶牛和肉牛胚胎移植技 术应用。 2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注明日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用本标准，然后，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的文件，其最新版本适用于本标准。 GB4143 84 牛冷冻精液 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。
3、 3.1 胚胎移植 （ Embryo transfer） 将良种母畜的早期胚胎取出，或者由体外受精及其它方式获取的胚胎，移植到生理状态相同的母畜体内，使之继续发育成为新个体的 过程。 3.2 供体 （ Donor） 提供胚胎或卵母细胞的母畜。 3.3 受体 （ Rebipient） 接受胚胎的母畜。 3.4 同期发情 （ Estrus synchronization） 利用外源性激素处理，人为地控制或调整母畜发情周期，使处于不同发情周期的母畜在同一时间（ 2 5d） 内发情。 3.5 超数排卵 （ Superovulation） 在发情周期的一定时间（通常在第 8 12d）内，给母牛注射促卵泡
4、素 （ FSH） 或孕马血清 （ PMSG）等促性腺激素，使卵巢上有更多的卵泡发育成熟并排卵。 3.6 发情 （ Estrus behave） 发情期母牛被观察 到稳定接受其他牛爬跨的表现。 3.7 冲胚液 （ mPBS） 用于采集胚胎的磷酸缓冲液。 3.8 保存液 （ olding solution） 用于胚胎保存或短期培养的组织培养液。 3.9 冷冻液 (Freezing solution) 用于胚胎冷冻的抗冻保护液。 3.10 解冻液 (Thawing solution) 用于冻胚解冻并复苏的生物制剂。 3.11 回收液 (Recycling solution) 在胚胎采集过程中，冲洗供
5、体子宫后，所回收到的冲卵液。 DB21/T 1648 2008 2 3.12 检胚 (Checking embryo) 在回收液中检查到胚胎，并将其移到保存液中的过程。 3.13 平衡 (Balancing) 在胚胎冷冻过程中，胚胎在同一温度、试剂浓度环境中停留一段时间，使其达到胚胎及其细胞内外的温度、渗透压等一致的过程。 3.14 植冰 (Ice seeding) 胚胎冷冻过程中，当温度降至冷冻液冰点或以下时（通常为 -5 -6），用浸入液氮冷却后的镊子夹住胚胎所处的上端液柱，使抗冻液瞬间产生冰晶。 3.15 程序冷冻法 (Programmed freezing) 借助程序控温仪使胚胎以适当
6、的速度缓慢降温而完成冷冻的方法。 4 超数排卵 4.1 供体牛的选择 4.1.1 符合本品种标准，具有较高的种用价值和生产性能。 4.1.2 年龄一般为 3 8 岁， 青年牛在 18 月龄左右，体格健壮，无遗传性疾病，繁殖机能正常。 4.1.3 经产母牛的产犊记录清楚，没有流产病史，产后 60d 以上，有两次正常发情记录。 4.1.4 生殖器官健康，不得患有子宫内膜炎、卵巢囊肿等疾病。子宫过度松弛下垂或屡配不孕的母牛不易做供体牛。 4.1.5 性情温顺。 4.2 供体牛的饲养管理 4.2.1 良好的营养状况是牛保持正常繁殖机能的必要条件，为供体牛提供足够的优质干草、青贮或多汁饲料、精料以及清洁
7、的饮水，保证日粮营养全面、平衡。 4.2.2 供体牛在采卵前后要特别注意保持良好的饲养环境，不得任意变换饲料和日常管理程序。 4.3 供体牛同期发情方法 4.3.1 孕激素与前 列腺素结合法。利用孕激素法处理供体牛实现同期发情主要有两种方式： a) 将有植物油和孕激素制剂调制的混悬液浸人阴道栓中，使用时将其放入阴道后穹隆处，阴道栓应放置 10 12d，取出后 36 48h牛只就会发情。 b) 用合成孕酮浸泡的硅酮植入体植入耳部皮下，应放置 10 12d，取出后 36 48h牛只就会发情。 4.3.2 前列腺素法。在发情周期正常的牛群中，在母牛发情后第 7d 子宫注入或肌肉注射氯前列烯醇，大部分
8、牛只在注射后的 3 4d 内会相继发情。 4.4 超数排卵处理方法 4.4.1 促卵泡素（ FSH）减量注射法。供体牛在发情后的 9 13d 肌注 FSH，早晚各一次，间隔 12h，分4d 减量注射，在第 3d 时每头供体牛同时肌注 PGF2a0.4 0.6mg。 4.4.2 孕马血清（ PMSG）处理法。在情期的 11 12d，一次肌注 PMSG 2500 3000IU， 48h 后宫注 PGF2a 2.4mg。发情后约 18h 肌注等量的抗孕马血清（ A-PMSG）。 4.5 授精 在观察到供体牛接受爬跨后 4 6h进行第一次输精，间隔 12h后第二次输精。输精时要将精液输入到两侧子宫角或
9、子宫体，每次有效精子数不得少于 50 106个，精液质量要符合 GB4143 84的规定，输精时不得触摸卵巢 。 5 采胚 5.1 采胚时间 以发情日为第 0d，第 6 8d收集胚胎。 5.2 冲胚液和采胚器械的准备 DB21/T 1648 2008 3 5.2.1 冲胚液准备。冲胚液可以直接从生产胚胎移植产品的专业公司购买，也可以自行配制。具体配制方法见本标准附录 A。 5.2.2 采胚器械的准备。灭菌处理过的冲胚管用 PBS 液冲洗 2 3 次，插人钢芯，检查气囊。准备好必要的麻醉剂、注射器、酒精棉和冲洗消毒剂等。 5.3 供体牛的麻醉 供体牛保定后，在第一、二尾椎骨间硬膜外注射 3 5m
10、l 2%的盐酸普鲁卡因，或肌注 1ml 2%静松灵。 5.4 供体牛外阴清洗消毒 麻醉后将牛尾竖直绑在保定架上，清除粪便，先用清水冲洗 会阴部及外阴，再用高锰酸钾液冲洗消毒，然后用灭菌卫生纸擦干，最后用酒精棉球消毒外阴部。 5.5 冲胚管导入 助手将准备好的冲胚管递到术者的右手。术者左手食指和拇指扒开阴门插人冲胚管，再将左手伸入 直肠，诱导冲胚管经子宫颈进人一侧子宫角至大弯处，抽出少许钢芯，再将冲胚管向前推，使其尖端靠 近子宫角深部；由助手持 30ml 注射器一次推入 10ml 空气，然后以 1ml 计数充气。根据子宫大小及冲卵管在子宫的位置确定充气量。一般青年牛充气 14 16ml，经产牛为
11、 18 25ml。冲胚管固定后抽出钢芯。一侧子宫角冲洗后，术者右手拉直 冲胚管，助手小心插人钢芯，左手在直肠内诱导钢芯插稳后，给气囊放气，再将冲胚管插人另一侧子宫角。 5.6 灌流 灌流需在温度为 20 左右的室内进行。灌流可采取如下两种方法： a) 将装有冲胚液的器皿挂在距外阴部 1.0 m高处，接通三通管（ Y型）和冲胚管。术者用右手控制进流和出流开关，每次灌 30 50ml冲胚液 ，由少到多，每侧子宫角冲 8 10次，每侧子宫注灌总量为300 500ml，与此同时，左手通过直肠轻轻按摩子宫角。 b) 用 50ml注射器，分次冲洗子宫角每次注入 30 50ml的冲胚液，由少到多，每侧子宫角
12、 冲 8 10次，每侧子宫注灌总量为 300 500ml，与此同时，左手通过直肠轻轻按摩子宫角。回收液收集在无菌加盖容器中。 5.7 术后处理 两侧子宫角冲卵完成后，从气囊放出一部分空气，将冲胚管抽至子宫体，灌注 10ml青霉素（ 80万 IU）和链霉素（ l00万 IU），拔出冲卵管。 6 检胚 检胚、胚胎质量鉴定、胚胎的冷冻及解冻等胚胎体外处理操作都要在无菌试验室内进行，试验室温度保持在 20 24 。 将回收液倒入集卵漏斗中，把多余溶液滤出，当漏斗中存留 20ml左右液体时，轻轻摇动漏斗并将溶液全部倒入底部刻有 1平方厘米左右方形格子 的直径 90mm培养皿中；将培养皿放在 8 20倍的
13、实体显微镜下，在溶液的底层逐格查找胚胎，检出的胚胎用 10 l的移液器移到装有保存液的培养皿中。 检胚要反复 2 3次，在每次检胚之前，都要用巴氏细管制作的检胚针充分搅动冲胚液，使粘附在组织碎片或粘液中的胚胎与之分离。 7 胚胎质量鉴定 7.1 胚胎发育阶段 发情第 6 8d所采集到的胚胎处于桑椹胚至囊胚阶段。表 1给出了不同发育阶段胚胎的特征： 表 1 不同发育阶段胚胎的特征 发育阶段 特 征 桑椹胚 （ M， Morula） 受精卵分裂到 32 个细胞以上，卵裂球隐约可见，内细胞团 几乎占满整个卵周间隙。 DB21/T 1648 2008 4 表 1 不同发育阶段胚胎的特征（续） 发育阶段
14、 特 征 致密桑椹胚 (CM,Compacted Morula) 卵裂球进一步分裂变小，看不清卵裂球之间的界限，卵裂球结合成团，内细胞团体积变小，约占卵周间隙的 60% 70%。 早期囊胚 (EB, Early Blastocyst) 细胞团内刚刚形成一个内含液体的透明囊腔，内细胞与滋养层细胞难以分清，细胞团占卵周隙的 70% 80%。 囊胚 (BL, Blastocyst) 囊胚腔扩大，滋养层细胞和内细胞团分化明显，细胞团充满整 个卵周隙。 扩张囊胚 (EXB,Expanded Blastocyst) 囊胚腔充分扩张，胚胎体积增大至 1.2 1.5 倍，透明带明显变薄。 7.2 可用胚胎的判
15、定 在 80 100倍的实体显微镜下对胚胎进行形态学观察，凡形状呈圆球形或接近圆球形，卵裂球大小一致、胞质均匀、连接紧密，内细胞团外部轮廓清晰、规则，含液泡、胞质浓缩呈颗粒状的退化细胞数 量少，卵周隙内没有或有少量外溢的退化细胞，明暗适中，发育阶段与胚龄相符的胚胎为可用胚胎。 7.3 等级评定 可用胚胎分为 A、 B、 C三级， A级和 B级胚胎可以直接移植，也可以冷冻，而 C级胚胎只能直接移植。表 2给出了胚胎等级评定标准。 表 2 胚胎等级评定标准 胚胎级别 评 定 标 准 A 级 胚胎形态完整、规则，内细胞团紧凑成球形、轮廓清晰，分裂球大小均匀、界线明显、连接 紧密，胚胎色调和明暗适中，
16、没有或只有 10%以下的游离细胞。 B 级 内细胞团轮廓清晰，卵裂球胞质均匀，色调适中，透明带有少许变形，有少许细胞突出，变 性细胞和游离细胞的比例不超过 30%。 C 级 内细胞团结构较松散，轮廓不清晰，色调发暗，已退化或游离细胞占 30% 50%。 8 胚胎冷冻 8.1 洗胚 将胚胎依次在保存液液滴中转移。洗胚时须 注意如下几点： a) 来自不同供体的胚胎，不能同时洗涤。 b) 清洗不同供体胚胎更换吸头。 c) 每枚胚胎至少洗涤 10次。 8.2 平衡 胚胎在冷冻液中平衡 10 20min。 8.3 胚胎装管 8.3.1 记录。在胚胎专用细管塞或标签纸上依次注明细管号、生产单位、品种、供体
17、母牛号、公牛号、 8.3.2 胚胎数、胚龄、胚胎质量和生产日期。 8.3.3 装管。用 1ml 的注射器将胚胎和冷冻液一同吸入细管中。使用乙二醇和甘油两种冷冻剂分别采用如下装管方法： a) 乙二醇冷冻剂的胚胎装管时，按含蔗糖的解冻液、乙二醇抗冻液、乙二醇抗冻液和胚胎、乙二醇抗冻液、含蔗 糖的解冻液的先后顺序吸入液柱，每两个液柱之间由少量的空气相隔。 b) 甘油抗冻剂的胚胎装管时，按甘油抗冻液、甘油抗冻液和胚胎、甘油抗冻液的先后顺序吸入液柱，每两个液柱之间由少量的空气相隔。 8.4 冷冻 DB21/T 1648 2008 5 胚胎冷冻应采用程序冷冻法。其降温及操作程序为：冷冻仪温度达到 -5 -
18、6时，将胚胎细管插入冷冻仪细管架内依次完成以下操作：平衡 5 10min，植冰，平衡 5 10min，以每分钟降低 0.3 0.5的速度降温至 -30 -35、平衡 5 10min。将冷冻后的胚胎放入液氮中长期保存。 9 胚胎解冻 将胚胎从液氮中取出，在 空气中垂直停留 8 10s（空气浴）后，快速插入 32 35的温水中，直至细管中的冰晶完全溶解。乙二醇和甘油为保护剂的冷冻胚胎溶解后分别采用不同的处理方法： a) 乙二醇保护剂冷冻胚胎直接装枪移植。 b) 甘油保护剂冷冻胚，在实体显微镜下将胚胎从细管中推出，用移胚器移入胚胎解冻液中，平衡4 5分钟，在保存液中清洗 5 6次装管后，再装枪移植。
19、 10 移植胚胎 10.1 选择受体牛的标准 10.1.1 年龄在 3 8 岁、健康、无疾病、体格较大、膘情好。 10.1.2 繁殖性能正常，产后 60d 以上，并有两次以上的自然发情记录。 10.1.3 泌乳性能好，无难产史。两 次人工授精未孕的牛不宜使用。 10.2 受体牛的饲养管理 10.2.1 做到精心管理，合理饲养，环境清洁。 10.2.2 牛群规模适量。 10.2.3 长期舍饲的母牛要加强运动。 10.2.4 防止在移植前后因饲料及环境改变造成应激反应。 10.3 受体牛同期发情 10.3.1 受体牛同期发情已采用如下两种方法： a) 一次 PGF2a诱导发情。一般在供体牛注射 P
20、GF2a前一天，给处于情期 8 15d直检黄体好的受体牛一次肌注 PGF2a 4ml诱导发情。 注 1：此种处理受体牛实现同期发情的方法主要应用于鲜胚移植，受体牛处理日程安排应与供体牛超排处理相吻合。 b) 两次 PGF2a处理。在不考虑发 情周期的情况下，可间隔 11d，前后两次 肌注 PGF2a 。 注 2：此种处理受体牛实现同期发情的方法主要应用于冷冻胚胎的移植。 10.3.2 发情观察。根据母牛接受爬跨确认发情，至少早、晚各观察 30min 发情情况。 10.3.3 对发情牛做直检以确认卵泡，次日上午或晚上确定是否排卵。若在发情后 36h 以后排卵不能用作受体。 10.3.4 供体牛、
21、受体牛的发情日差。受体牛的发情日比供体牛早一天为 1，晚一天为 1，同日发情为 0。超过 2d 不能用于移植。可将致密桑棋胚移植给发情 6d 的受体牛，将早期囊胚移植给发情 7d的受体牛，将囊胚胎和扩大囊胚移植给发情 8d 的 受体牛。 10.4 移植前受体牛的检查 要求受体牛发情时直检的卵泡直径在 10 20mm 左右，发情后 36h内出现排卵。移植前一天直检黄体，其直径在 11 15mm以上，黄体的手感弹性好，质地软而充实。 10.5 受体牛的保定与消毒 将受体牛保定，清除粪便，肌注 2%静松灵 1ml或用 2%的普鲁卡因 3ml在 l、 2尾椎间硬膜外麻醉。 10.6 移植 将准备后的胚
22、胎细管装入胚胎移植枪，术者用左手扒开外阴，右手持移植器插入阴道。然后左手伸进直肠，移植器到达子宫颈口时，右手用力将移植枪捅破软外套，插入子宫颈。左手在直肠内诱导使枪头插入黄体侧子宫角至大 弯处，持移植枪的右手推出胚胎，缓慢旋转地抽出移植枪。 DB21/T 1648 2008 6 11 妊娠诊断 妊娠诊断采用如下两种方法： a) 直肠检查法 通常在移植后 3个月开始检查。妊娠 90d左右时，直检可感觉到胎儿的浮动，孕角出现孕脉，子宫壁可触到子叶。 b) 超声波诊断（ B超） 对妊娠 25d以上的受体牛可用 B超检查。利用探头通过直肠轻轻地在子宫角滑动，在荧光屏上便可观察到周围黑色中间有一个长 1
23、 2mm灰白色图像，即是胎儿 。胎儿 60日龄时为 6 7cm长， 90日龄时为 1417cm长。 使用 B超探头检查时要特别注意，防止动作过重，引起流产。 DB21/T 1648 2008 7 附 录 A （规范性附录） 冲卵液配制 A.1 冲卵液的配制有如下两种途径： a) 从生产胚胎移植产品的专业公司购买冲卵粉配制冲卵液。冲卵粉在使用前按产品的使用说明，将 A、 B粉分别加入电阻值为 18.2M /cm 2 五蒸水充分搅拌溶解后混合、定容、灭菌。 b) 购买化学和生物制剂配制冲卵液，表 1冲卵液配方给出了实验室配制冲卵液的配方。 表 冲卵液配方 单位： g/l 类别 成分 含量 A 液
24、NaCl 8.00 KCl 0.20 MgCl2 0.10 CaCl2 0.10 B 液 Na2HPO4 12H2O 2.898 KH2PO4 0.20 丙酮酸钠 0.036 葡萄糖 1.00 C 液 青霉素 0.075 链霉素 0.005 牛血清白蛋白 3.00 A.2 配制冲卵液时要注意以下几点： a) 所使用的化学试剂均应为分析纯。 b) 所用纯净水的电阻值应为 18.2M /cm 2。 c) 如使用过滤灭菌， A、 B液混合后灭菌；如采用高压灭菌， A液和 B液分别灭菌，冷却后混合。高压灭菌的要求是压力 10磅，时间 20min。 d) C液在使用前加入。 配制的 PBF液 PH值为
25、7.2 7.6，渗透压为 270 290mos。 DB21/T 1648 2008 8 附 录 B （资料性附录） 记录表 表 1 供体牛超数排卵记录 牛 号 发 情 时 间 发 情 方 式 第 1 天FSH 第 2 天FSH 第 3 天 FSH 第 4 天 FSH 发情 时 间 配种 时间 冲 胚 时 间 回 收 胚 胎 可 用 胚 胎 可 用 比 率 时间 次数 时间 剂量 时间 剂量 时间 剂 量 PG 时间 剂量 取 CIDR DB21/T 1648 2008 9 表 2 供体牛冲胚记录 供体号 品种 产犊 时间 胎 次 年 龄 产奶量 处理前发 情的时间 直检 情况 促卵泡素 批号
26、总剂量 前列 腺素 剂量 批号 公牛号 冲卵 日期 开始 时间 结束 时间 冲胚人 检胚人 回收 胚数 未受精 卵数 退化 胚数 可用 胚数 胚 胎 的 发 育 与 等 级 等 级 M BM EB BL EXB HB 左 侧 卵 巢 A B C 左 侧 卵 巢 A B C DB21/T 1648 2008 10 表 3 胚胎冷冻及解冻记录 供体号： 品种： 操作者： 冲卵结束时间： 冷冻时间： 防冻剂： 冷冻方法： 序 号 发育 阶段 级 别 特征 简图 Cane 号 码 简 号 解冻 温度 脱甘油 方 式 解冻 后形 态 培养 情况 用 途 备 注 DB21/T 1648 2008 11 表 4 受体牛移植记录 序 号 畜 主 受体牛 特 征 同期 发情 发情 日期 排卵 日期 黄体 发育 移植 时间 胚胎 等级 妊检 术者 移植 地点 备注 B21/T -
