1、 ICS 65.150 B 09 DB14 山西省 地 方 标 准 DB 14/ T711 2012 虹鳟三倍体制种技术规范 点击此处添加标准英文译名 点 击此处添加与国际标准一致性程度的标识 文稿版次选择 2012 - 12 - 25 发布 2013 - 01 - 25 实施 山西省质量技术监督局 发布 DB14/ T711 2012 I 目 次 前言 II 1 范围 1 2 规范性引用文件 1 3 术语和定义 1 4 制种工艺 1 5 倍性检测 3 附录 A（资 料性附录） 鱼类倍性的 DNA 含量检测方法 4 DB14/ T711 2012 II 前 言 本标准按照 GB/T1.1-20
2、09给出的规则起草。 本标准由山西省水利厅提出 并归口 。 本标准起草单位：山西省水产科学研究所 本标准主要起草人：杨孟科、宁毅、武雨欣、李晓东、崔红。 DB14/ T711 2012 1 虹鳟三倍体制种技术规范 1 范围 本标准规定了虹鳟三倍体 制种 的 术语和定义、制种工艺和倍性检测 。 本标准适用于 山西省境内 虹鳟三倍体的制 种 。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文 件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 18654.14 养殖鱼类种质检验 第 14 部分： DNA 含量
3、的测定 SC/T 1030.3 虹鳟养殖技术规范 人工繁殖技术 SC 1036 虹鳟 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 3.1 三倍体 Triploid 在自然作用或人为控制下，形成的 具有 3套 染色体的生物个体。 3.2 温度休克法 Temperature shock method 把适宜发育期的鱼类受精卵 或 胚胎在略高于（冷水鱼）或略低 于（温水鱼）的亚致死温度下，处理一定时间，诱导产生多倍体的方法。 3.3 静水压休克法 Hydrostatic pressure shock method 把适宜发育期的鱼类受精卵 或 胚胎放置于水压机中，施一定压力的静水压处理一定时间，诱
4、导产生多倍体的方法。 4 制种工艺 4.1 温度休克诱导 4.1.1 主要设备及要求 DB14/ T711 2012 2 4.1.1.1 电热水箱：箱体由不锈钢或聚苯塑料制成，箱外壁设置有保温层。形状为长方形，尺寸为 300 cm 40 cm 60 cm，有效容积为 500 L 600 L。箱内 底部 设有 加热器 ，且 全底均匀布置 。 4.1.1.2 温度控制器：用于控制电热水箱的水 温并保持恒温 。 具有 LED 显示功能，其控温范围 -1050，精度小于 0.5 。设置温度传感器探头 3 个 4 个， 分别通过箱盖平均安装在电热水箱两宽边的中线上，探头在 水面 下 5cm 20cm 处
5、。 4.1.1.3 桶 式 孵化 器 ： 用于鱼类受精卵的孵化及 温度 休克处理，其构造见于 SC/T 1030.3。孵化器 底部设 有 排水栓， 1 min 2 min 内可将水排干。 4.1.1.4 注水龙头：有水箱注水龙头和孵化桶注水龙头之分，其中水箱注水龙头用于将孵化用水（水温 8 10 ）注入电热水箱中，孵化桶注水龙头用于将孵化用水注入孵化桶中。注水流量为 3 L/min5 L/min。 4.1.1.5 虹吸管：用于 将 加热后的 水 从电热水箱 虹吸入孵化桶 中。用固定杆将 虹吸管口固定在 电热水箱 底以上 5 cm 处。每分 钟 供水 3 L。 4.1.1.6 电磁式空气泵：无油
6、设计，排气压力不小于 0.3 kg/cm2，排气量不小于 0.05 m3/min。 4.1.2 亲鱼要求 4.1.2.1 亲鱼为二倍体，其种质应符合 SC 1036 的规定。体质应健壮、无病、无伤、无畸形。雌鱼宜在 3 龄以上，其卵子呈桔红色或橙黄色，卵粒圆而饱满，大小均匀；雄鱼宜在 2 龄以上。 4.1.2.2 亲鱼 培育水温 低于 13 ， 放养密度 小于 3 尾 /m2，池水 溶氧保持 在 7mg/L 以上。 4.1.3 精、卵采集与人工授精 精、卵采集及人工授精按照 SC/T 1030.3进行。将 受精后的 鱼 卵立即置于 桶式孵化器的 8 10 流水中，每桶可盛卵 2万粒 3万粒，供
7、水量为 2L/min 3L/min。 4.1.4 加温与控温 精、卵采集前， 开启水箱注水龙头，向电热水箱中注水。当水位升至 50cm高度时，停止注水，并接通加热器和温度控制器的电源，使箱内水温上升并保持 在 29 。 4.1.5 诱导方法 当 孵化器中的 受精卵发育 累积 温 度 达到（ 2 0.2） h时，关掉孵化器注水龙头， 停止 向孵化器供水， 并 打开桶底排水栓，水全部放干后，立即 用虹吸管从电热水 箱向孵化器中 注入 29 的水 ， 1 min2 min内注满后，注水量 保持在 3L/min 4 L/min。 10min后，停止注入水， 并 打开桶底排栓， 1 min 2 min内
8、将水排干后， 再 立即注入 孵化用水（水温 8 10 ）， 按 SC/T 1030.3规定进行常规孵化 。 鱼卵处理期间，应用 电磁式空气泵 进行 充气，保证水中溶氧在 6mg/L以上。 4.2 静水压诱导 4.2.1 设备要求 静水压力机主要包括手动加压杠杆、压力表及容卵钢筒。压力范围 0 kg/cm2 1000 kg/cm2，容卵钢筒有效容积在 500mL 1000mL之间。 4.2.2 亲鱼要 求 按 4.1.2的 要求执行。 4.2.3 精、卵采集与人工授精 DB14/ T711 2012 3 按 4.1.3的要求执行。 4.2.4 诱导方法 当受精卵 的 胚胎发育有效积温达到（ 2
9、0.2） h时， 捞出 3000粒 5000粒 鱼卵 装 入静水压力 机中，加 入 孵化用水， 使水 高出卵层 3cm。快速 加压至 650kg/cm2，处理 6min 10min后， 将静水压力机的压力快速降至 0。轻轻倒出鱼卵， 移入 至 孵化 容器中 ， 按 SC/T 1030.3的规定 实施常法孵化。 4.3 杂交制种 4.3.1 亲鱼要求 四倍体虹鳟和普通二倍体虹鳟 通过 杂交 也可以获得三倍体 。 二倍体 虹鳟 亲鱼 按 4.1.2的要求， 四倍体 虹鳟 亲鱼 直 接引进亲鱼或者由引进的虹鳟四倍体苗种培育而成。要求健康、无病，雌性亲鱼 年龄 在 3龄 以上，雄性亲鱼年龄在 2龄 以
10、上 。 4.3.2 人工授精及孵化 用虹鳟四倍体作父本（或母本），虹鳟二倍体作母本（或父本），采用 SC/T 1030.3的方法采集精卵，并进行人工授精与孵化。 5 倍性检测 5.1 检测材料的选用 用活鱼的血液或尾鳍组织作为材料进行虹鳟的倍性检测。 5.2 检测时机 被检鱼体重在 30g以上。 5.3 检测数量 检测数量在 100尾以上。 5.4 检测方法 采用 DNA含量检测法 对虹鳟倍性进行检测 ，其方法 参见 附录 A。 5.5 检测后的处理 被检鱼取血后，应立即在伤口 处涂抹土霉素软膏，以防感染，同时作好标记和记录。不同批次的被检鱼应隔离，分开饲养。 DB14/ T711 2012
11、4 A A 附 录 A （资料性附录） 鱼类倍性的 DNA 含量检测方法 A.1 试剂与材料 A.1.1 70%乙醇水溶液。 A.1.2 磷酸盐缓冲液（ PBS）： Na2HPO4 12.35g， NaH2PO4 H2O 20.3g，蒸馏水定容至 1L。 A.1.3 PI综合染液：碘化丙啶（ PI） 25mg， 聚乙二醇辛基苯基醚 （ Triton X-100） 2.5mL，核糖核酸酶（ RNase） 5mg，柠檬酸三钠 250mg，用蒸馏水配至 250mL。 A.1.4 生理盐水： 0.75%氯化钠（ NaCl）水溶液。 A.1.5 卡诺氏液 ： 3份 甲醇 加 1份 冰乙酸 ，现配现用。
12、A.2 仪器与设备 A.2.1 离心机：最高转速 5000r/min，常温。 A.2.2 10mL离心管。 A.2.3 流式细胞仪。 A.2.4 荧光显微镜 。 A.2.5 尼龙网布： 300目。 A.2.6 镊子。 A.2.7 烧杯。 A.3 检测方法 选用活体鱼的血液或尾鳍组织作为检测材料进行虹鳟的倍性检测。 A.3.1 检测血液 方法（包括鸡血标定） 按 GB/T 18654.14的规定执行 。根据 三倍体 DNA含量为二倍体的 1.5倍 、 四倍体 DNA含量为 二倍体的 2倍 ， 确定其倍性。 A.3.2 检测尾鳍组织 A.3.2.1 剪 取活体鱼样的 一小块尾鳍固定于 70%酒精溶
13、液中 ， 4 保存 至 12h。 A.3.2.2 将剪碎的尾鳍组织置于扎有尼龙 网 布 的小烧杯上 ， 用镊子在网上轻搓组织块 ， 同时加生理盐水 ， 直至组织搓完为止。 A.3.2.3 将收集到的细胞悬液 用离心机（ 1000r/min） 离心 5min， 弃上清液 ， 用磷酸盐缓冲液 （ PBS）洗涤 2 次 3 次 。 A.3.2.4 荧光显微镜下将细胞浓度调至 1106 个 /mL， 加 1mLPI 综合染液 ， 置于 4 冰箱中染色 30min。 A.3.2.5 离心洗去 PI 染液 ， 加少许 PBS， 用流式细胞仪进行 DNA含量分析法进行鉴定 。 A.3.2.6 根据 三倍体 DNA含量为二倍体的 1.5倍 、 四倍体 DNA含量为 二倍体的 2倍 ， 确定其倍性 。 DB14/ T711 2012 5 _
