1、1微生物的培养与应用(30 分钟 100 分)1.(9 分)(2019广西三市联考)在炎热的夏天，新鲜的肉若不及时处理，不久其表面便因微生物生长出现黏液状物质。通过菌落特征可确认此微生物为细菌。请回答以下问题：(1)培养细菌常用到选择培养基。培养基中不加入_可以选择培养自养型微生物。 (2)微生物接种最常用的是平板划线法和_法。后一种方法还可用于活菌计数，其原理是_。除了上述的活菌计数法外，_也是测定微生物数量的常用方法。 (3)分解尿素的细菌的分离，需在培养基中加入_指示剂。而分解纤维素的微生物的分离，需在培养基中加入_(染料)来筛选。 【解析】(1)自养型微生物可以利用无机碳源合成有机物，
2、因此培养基中不加入有机碳源可以选择培养自养型微生物。(2)微生物常用的接种方法有平板划线法和稀释涂布平板法，其中稀释涂布平板法还可以用于菌种的计数，其原理是：当样品的稀释度足够高时，培养基表面的一个菌落来源于稀释液中的一个活菌，通过统计菌落数，就能推测样品中的活菌数；此外微生物还可以用显微镜直接计数。(3)微生物的鉴定常用鉴别培养基，在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，观察是否变红，可用来鉴定分解尿素的细菌；在以纤维素为唯一碳源的培养基中加入刚果红，观察是否有透明圈产生，可用来鉴定纤维素分解菌。答案：(1)有机碳源(2)稀释涂布平板 当样品的稀释度足够高时，培养基表面的一个菌落来源于稀
3、释液中的一个活菌，通过统计菌落数，就能推测样品中的活菌数 显微镜直接计数(3)酚红 刚果红2.(10 分)生物兴趣小组尝试运用所学的知识对某河段的大肠杆菌的数量进行检测。请回答下列相关问题：(1)配制培养基时加入的乳糖属于培养基成分中的_。对培养基进行灭菌时，一般使用_(填仪器名称)。灭菌后，待冷却至 50 左右时，在酒精灯火焰附近_。大肠杆菌在伊红美蓝培养基上生长呈黑色菌落，从功能上划分，该培养基属于_培养基。 2(2)在接种前，随机取若干灭菌后的空白平板先行培养了一段时间，这样做的目的是_。 (3)检测大肠杆菌含量时，将 1 mL 河水样品稀释 10 倍，在 3 个平板上分别接入 0.1
4、mL 稀释液；经适当培养后，3 个平板上的黑色菌落数分别为 62、65 和 68。据此可得出每升样品中的活菌数为_个。 (4)该小组通过统计菌落的数目，计算出单位体积样品中大肠杆菌数目，理论上他们的统计值比实际值_(填“偏高”或“偏低”)，理由是_。 【解析】(1)乳糖是二糖，由 C、H、O 三种元素组成，可以为微生物的培养提供碳源。培养微生物的培养基一般使用高压蒸汽灭菌锅进行灭菌。灭菌后，待冷却至 50 左右时，在酒精灯火焰附近倒平板。大肠杆菌在伊红美蓝培养基上生长呈黑色菌落，从功能上划分，该培养基属于鉴别培养基。(2)在接种前，随机取若干灭菌后的空白平板先行培养了一段时间，作为空白对照，以
5、检测培养基平板灭菌是否合格。(3)3 个平板上的黑色菌落数分别为62、65 和 68，则 3 个平板上黑色菌落的平均数为 65，因此每升样品中的活菌数=650.11 00010=6.5106(个)。(4)由于在培养过程中两个或多个大肠杆菌连在一起时，平板上只能观察到 1 个菌落，因此理论上他们的统计值比实际值偏低。答案：(1)碳源 高压蒸汽灭菌锅 倒平板 鉴别(2)检测培养基平板灭菌是否合格 (3)6.510 6(4)偏低 两个或多个大肠杆菌连在一起时，平板上只能观察到 1 个菌落3.(10 分)莠去津是一种含氮农药，在土壤中不易降解，为修复被其污染的土壤，可按下面程序选育能降解莠去津的细菌(
6、目的菌)。请据图回答：(已知莠去津在水中溶解度低，含过量莠去津的固体培养基不透明)(1)由图推断，从 A 瓶到 C 瓶液体培养的过程称为_，目的是_。 3(2)在将 C 瓶菌种接种到固体培养基之前通常要进行_，将菌种接种到固体培养基的方法有平板划线法和_法，从图中看本实验采用的是_(填“前者”或“后者”)。(3)一段时间后，培养基出现无透明圈和有透明圈两种菌落，我们筛选的目的菌是菌落中_的细菌，该菌落生长所需的氮元素主要来自_。 (4)为弄清固体培养基中的非目的菌落来自 C 瓶菌种还是培养基，应如何设置对照组？_。 【解题指南】(1)关键信息：“莠去津是一种含氮农药”“含过量莠去津的固体培养基
7、不透明”。(2)隐含信息：无氮培养基+过量莠去津为以莠去津为唯一氮源的选择培养基。图中菌落分布均匀的培养基是利用稀释涂布平板法接种获得的。【解析】(1)图中从 A 瓶到 C 瓶液体培养的过程称为选择培养，目的是初步选择能降解莠去津的细菌(目的菌)并提高其密度。(2)将菌种接种到固体培养基的方法有平板划线法和稀释涂布平板法两种，由图中固体培养基上的菌落分布可知，该接种方法是稀释涂布平板法，包括梯度稀释操作和涂布平板操作。(3)根据题目信息“莠去津在水中溶解度低，含过量莠去津的固体培养基不透明”可知，能够降解莠去津的目的菌分解莠去津，使菌落周围出现透明圈，因此可以选择菌落周围存在透明圈的细菌。由于
8、培养基中只有莠去津一种氮源，因此分解莠去津的微生物所需的氮元素主要由莠去津提供。(4)为弄清固体培养基中的非目的菌落来自 C 瓶菌种还是培养基，应设置灭菌后不接种菌种的培养基，与实验组放在相同条件下培养，若培养基上无菌落出现，则非目的菌落来自 C瓶菌种，若培养基上出现菌落，则说明非目的菌落可能来自培养基。答案：(1)选择培养 初步选择能降解莠去津的细菌(目的菌)并提高其密度(2)梯度稀释 稀释涂布平板 后者(3)有透明圈 莠去津(4)配制的培养基灭菌后不接种菌种，与实验组放在相同条件下培养4.(10 分)水污染是全球性的环境问题，微生物降解是水污染治理的有效手段之一。聚乙烯醇(PVA)是存在于
9、化工污水中的一种难以降解的大分子有机物，PVA 分解菌能产生 PVA 酶分4解 PVA，PVA 与碘作用时能产生蓝绿色复合物，当 PVA 被分解时蓝绿色复合物消失，形成白色透明斑，请回答下列问题：(1)要从土壤中筛选出能高效分解 PVA 的细菌，应采用以_为唯一碳源的选择培养基，实验中还应设置对照组。将菌液稀释相同的倍数，对照组培养基上生长的菌落数目应明显_(填“多于”或“少于”)选择培养基上的数目，从而说明选择培养基具有筛选作用。(2)要测定土壤稀释液中微生物的数目，可在显微镜下用_计数板直接计数。若将100 mL 含有 PVA 分解菌的土壤样品溶液稀释 104倍后，取 0.1 mL 稀释液
10、均匀涂布在选择培养基表面，测得菌落数的平均值为 160 个，空白对照组平板上未出现菌落，则 100 mL 原菌液中有 PVA 分解菌_个。 (3)要鉴定分离出的细菌是否为 PVA 分解菌，培养 PVA 分解菌的培养基中除了加入必需的营养物质外，还需要加入_用于鉴别 PVA 分解菌。要比较不同菌株降解 PVA 能力的大小，用含相同 PVA 浓度的上述培养基来培养不同菌株，一定时间后，通过测定_来确定不同菌株降解 PVA 能力的大小。 【解析】(1)要从土壤中筛选出能高效分解 PVA 的细菌，应采用以聚乙烯醇(PVA)为唯一碳源的选择培养基，目的是淘汰不能分解聚乙烯醇(PVA)的细菌。实验中设置的
11、对照组培养基上生长的菌落数目应明显多于选择培养基上的数目，因为对照组没有淘汰不能分解聚乙烯醇(PVA)的细菌。(2)在显微镜下计数微生物细胞的数量可直接用血细胞计数板计数。根据题意，100 mL 原菌液中 PVA 分解菌的数量为 1600.1104100=1.6109(个)。(3)根据题意可知，要鉴定分离出的细菌是否为 PVA 分解菌，培养 PVA 分解菌的培养基中除了加入必需的营养物质外，还需要加入碘用于鉴别 PVA 分解菌。要比较不同菌株降解 PVA 能力的大小，用含相同 PVA 浓度的上述培养基来培养不同菌株，一定时间后，通过测定白色透明斑的大小(直径)来确定不同菌株降解 PVA 能力的
12、大小。答案：(1)聚乙烯醇(PVA) 多于(2)血细胞 1.610 9 (3)碘 白色透明斑的大小(直径)5.(10 分)如图表示分离、纯化及保存枯草芽孢杆菌菌株的简要过程，回答下列问题：5(1)将土壤表层泥土稀释液煮沸 15 min 后获得的样品中，仍含有一些活的菌种，原因是_。 (2)图中将菌种接种到平板 1 的方法是_；将菌种接种到平板 2 之前，接种工具常用_法进行灭菌。为了逐步分离、纯化得到目的菌种，平板 1 和平板 2 中的培养类型都应该属于_培养基。对于频繁使用的菌种可接种到题图试管中的_培养基上临时保藏。 (3)用稀释涂布平板法在 5 个平板上都接种稀释倍数为 104的样品液
13、0.1 mL，培养一段时间后，平板长出来的菌落数分别为 182、160、168、175 和 190，据此推测，每毫升样品液中的细菌数量为_个。稀释涂布平板法能够通过统计平板上的菌落数来推测样品中的活菌数目，原因是_ _。 【解析】(1)煮沸消毒法不能杀死细菌的全部芽孢和孢子，因此土壤表层泥土稀释液煮沸15 min 后获得的样品中，仍含有一些活的菌种。(2)分析题图可知，图示平板 1 利用涂布器进行涂布，即题图中将菌种接种到平板 1 的方法为稀释涂布平板法；将菌种接种到平板2 之前，接种工具常用灼烧灭菌(或灼烧)法进行灭菌。为了逐步分离、纯化得到目的菌种，平板 1 和平板 2 中的培养类型都应该
14、属于选择培养基。对于频繁使用的菌种可接种到题图试管中的固体斜面培养基上临时保藏。(3)每毫升样品液中的细菌数量为(182+160+168+175+190)50.1104=1.75107(个)。当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，因此稀释涂布平板法能够通过统计平板上的菌落数来推测样品中的活菌数目。答案：(1)煮沸消毒法不能杀死细菌的全部芽孢和孢子 (2)稀释涂布平板法 灼烧灭菌(或灼烧) 选择 固体斜面(3)1.75107 当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌6.(10 分)为了调查某河流的水质状况，某研究小组
15、测定了该河流水样中的细菌含量，并进行了细菌分离和培养等工作。回答下列问题：(1)该小组采用稀释涂布平板法检测水样中细菌含量。将 1 mL 水样稀释 1 000 倍，在 3 个平板上用涂布法分别接入 0.1 mL 稀释液；经适当培养后，3 个平板上的菌落数分别为39、38 和 37，据此可得出每升水样中的活菌数为_个。 6(2)该小组采用平板划线法分离水样中的细菌。操作时，接种环通过_灭菌，为了将聚集的菌体逐步稀释以便获得单个菌落，在第二次及以后的划线时，一定要_，示意图 A 和 B 中，_表示的是用稀释涂布平板法接种培养后得到的结果。通常，对获得的纯菌种可以依据_对细菌进行初步的鉴定和分类。
16、(3)该小组将得到的菌株接种到液体培养基中并混匀，一部分进行静置培养，另一部分进行振荡培养。结果发现：振荡培养的细菌比静置培养的细菌生长速度快。分析其原因是：振荡培养能提高培养液中_的含量，同时可使菌体与培养液充分接触，提高_的利用率。 【解析】(1)由题意知，1 mL 水样中的菌落数是(39+38+37)30.11 000=3.8105，每升水样中的活菌数为 3.8105103=3.8108(个)。(2)接种环用灼烧法进行灭菌。在第二次及以后划线时，总是从上一次划线的末端开始划线，这样做的目的是通过划线次数的增加，将聚集的菌体逐渐稀释分散，使每次划线时菌体的数目逐渐减少，以便获得由单个细胞繁
17、殖而来的单个菌落。图 A 是用平板划线法接种培养后得到的结果，图B 表示的是用稀释涂布平板法接种培养后得到的结果。可以依据菌落的形状、大小等特征对细菌进行初步的鉴定和分类。(3)振荡培养可以增加液体培养基的氧气含量；同时还能使菌体与培养液充分接触，提高营养物质的利用率。答案：(1)3.810 8(2)灼烧 从上一次划线的末端开始划线 B 菌落的形状、大小等特征(3)溶解氧 营养物质7.(11 分)金黄色葡萄球菌是一种具有高度耐盐性的微生物，可引起人类肺炎、肠炎等疾病。金黄色葡萄球菌在血平板(培养基中添加适量血液)上生长时，可破坏菌落周围的红细胞，使其褪色。如图为定性检测鲜牛奶中是否存在金黄色葡
18、萄球菌的操作流程，请回答下列相关问题：7(1)按细胞结构分类，金黄色葡萄球菌属于_生物，从培养过程分析，金黄色葡萄球菌可进行_呼吸。 (2)7.5% NaCl 肉汤培养基为微生物提供的营养成分包括_，用 7.5% NaCl 肉汤培养基进行选择培养的主要目的是_。 (3)操作中在血平板上的接种方法是_，接种操作前后需要对接种工具进行_灭菌。 (4)在制备血平板时需将 pH 调节至_(填“微酸性”或“微碱性”)后灭菌，待培养基_后，再加入适量血液。按培养基功能分类，血平板属于_培养基。 (5)经多次规范操作、重复实验，血平板上均出现_的菌落，初步证明鲜牛奶中存在金黄色葡萄球菌，但鲜牛奶供应商仍认为
19、此菌并非鲜牛奶所携带，因此，要对本操作进行完善，完善的方案是_。 【解析】(1)金黄色葡萄球菌是一种细菌，属于原核生物。培养过程没有进行密闭处理，故金黄色葡萄球菌可进行有氧呼吸。(2)7.5% NaCl 肉汤培养基可为微生物提供生长所需要的碳源、氮源、水和无机盐。用 7.5% NaCl 肉汤培养基进行选择培养是为了增加高度耐盐性的金黄色葡萄球菌的数量。(3)图示用的接种工具是接种环，说明在血平板上接种的方法是平板划线法。接种工具在接种前后都要进行灭菌处理。(4)金黄色葡萄球菌的生长环境为弱碱性，培养基在灭菌前要先调节 pH，因金黄色葡萄球菌能破坏红细胞，使其褪色，血平板上出现周围存在透明圈的菌
20、落，说明有金黄色葡萄球菌，故血平板是鉴别培养基。(5)为增强实验结论的严谨性，应增加空白对照组。答案：(1)原核 有氧(2)碳源、氮源、水和无机盐 增加高度耐盐性的金黄色葡萄球菌的数量(3)平板划线法 灼烧 (4)微碱性 冷却 鉴别(5)周围存在透明圈 设置不加鲜牛奶，其他操作均相同的对照组81.(15 分)为探究大肠杆菌 CV101 菌株和 CV103 菌株的营养需求，某团队在营养成分相同的含醋酸盐的培养液中分别接种 CV101 菌株和 CV103 菌株，并置于相同且适宜的环境中培养，每隔一段时间统计两种菌株的生长状况。实验数据如图所示，回答下列问题：(1)醋酸盐培养基从物理性质上来看属于_
21、培养基，该培养基主要应用是_；从功能上来看属于_培养基。 (2)由图可知：更适应醋酸盐培养基环境的菌株是_，其依据是_。原因是_。 (3)若要统计培养 30 小时后醋酸盐培养基中的 CV101 活菌数，可采用_法；为保证能在固体培养基上获得单个菌落，接种前，需取 1 mL 该菌液进行_处理。 【解析】(1)根据题干信息分析，某团队在营养成分相同的含醋酸盐的培养液中分别接种CV101 菌株和 CV103 菌株，因此该培养基属于液体培养基，有利于菌种的扩大培养；从功能上看其属于选择培养基。(2)据题图分析可知，在一定时间内，CV101 菌株在该培养基中数量持续增多，而 CV103 菌株的数量减少且
22、维持在较低水平，说明 CV101 菌株能以醋酸盐为碳源，因此 CV101 菌株是更适应醋酸盐培养基环境的菌株。(3)常用的微生物接种方法有平板划线法和稀释涂布平板法，其中后者可以用于菌种的计数；为保证能在固体培养基上获得单个菌落，接种前，需取 1 mL 该菌液进行梯度稀释处理。答案：(1)液体 扩大培养 选择(2)CV101 菌株 在一定时间内，CV101 菌株在该培养基中数量持续增多，而 CV103 菌株的数量减少且维持在较低水平 CV101 菌株能以醋酸盐为碳源(3)稀释涂布平板 梯度稀释2.(15 分)(2018南昌模拟)纤维素分解菌是人们生活中应用广泛的一种微生物，其中含有的纤维素酶(
23、蛋白质类物质)能够分解纤维素。回答下列有关问题：(1)组成纤维素的单体是_。在某真菌细胞中与纤维素酶合成分泌直接有关的具膜细胞器是_。 9(2)在筛选纤维素分解菌的过程中，人们发明了_染色法，这种方法能够通过_直接对微生物进行筛选。 (3)利用人工诱变的方法处理某纤维素分解菌后，如何从其中筛选出分解纤维素能力强的生产用菌种？请简要写出：实验思路：_。 从突变的不定向性角度，预测观察到的实验结果(提示：培养基中纤维素被降解后，产生纤维素酶的菌落周围将会出现明显的透明圈)：_。 【解析】(1)组成纤维素的单体(基本单位)是葡萄糖。某真菌细胞中合成的纤维素酶属于分泌蛋白，在分泌蛋白的合成和分泌过程中
24、，依次通过的细胞结构是：核糖体内质网高尔基体细胞膜，整个过程需要线粒体提供能量，其中细胞膜不属于细胞器，核糖体没有膜结构。可见，在某真菌细胞中与纤维素酶合成分泌直接有关的具膜细胞器是内质网、高尔基体。(2)刚果红可与纤维素形成红色复合物，当纤维素被纤维素酶水解后，刚果红-纤维素复合物就无法形成，培养基中会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈。据此，在筛选纤维素分解菌的过程中，人们发明了刚果红染色法，这种方法能够通过颜色反应直接对微生物进行筛选。(3)结合对(2)分析可知：欲筛选纤维素分解菌，需在加入刚果红、且以纤维素为唯一碳源的培养基中培养相应的微生物，当形成菌落以后，可以根据菌落周围是否产生透明
25、圈进行筛选，且透明圈越大，分解纤维素能力越强。由于基因突变具有不定向性，因此在培养基中可能有透明圈较大的菌株，也可能有透明圈较小的菌株。答案：(1)葡萄糖 内质网、高尔基体 (2)刚果红 颜色反应 (3)将诱变得到的纤维素分解菌培养在含有纤维素和刚果红的培养基中，选出透明圈大的菌株为生产用菌株 在培养基中可能有透明圈较大的菌株，也可能有较小的菌株【方法技巧】筛选微生物的三种方法(1)单菌落挑取法：利用平板划线法或稀释涂布平板法接种到固体平板培养基表面，直接根据微生物菌落的特征利用单菌落挑取的方法获得目的微生物。(2)选择培养法：利用选择培养基对微生物进行选择培养，直接获得目的微生物。(3)鉴定培养法：利用鉴定培养基使目的微生物菌落呈现特有的特征，然后筛选目的微生物。10
