1、第15讲 基因工程及克隆技术,考试要求 1.工具酶的发现和基因工程的诞生(/a)。2.基因工程的原理和技术(/b)。3.基因工程的应用(/a)。4.提出生活中的疑难问题，设计用基因工程技术解决的方案(/c)。5.植物的克隆(/b)。6.动物的克隆(/a)。,1.(2018浙江4月选考)回答与基因工程和植物克隆有关的问题：(1)将含某抗虫基因的载体和含卡那霉素抗性基因的载体pBI121均用限制性核酸内切酶EcoR酶切，在切口处形成_。选取含抗虫基因的DNA片段与切割后的pBI121用DNA连接酶连接，在两个片段相邻处形成_，获得重组质粒。(2)已知用CaCl2处理细菌，会改变其某些生理状态。取C
2、aCl2处理过的农杆菌与重组质粒在离心管内进行混合等操作，使重组质粒进入农杆菌，完成_实验。在离心管中加入液体培养基，置于摇床慢速培养一段时间，其目的是_，从而表达卡那霉素抗性基因，并大量增殖。,(3)取田间不同品种水稻的幼胚，先进行_，然后接种到培养基中培养，幼胚发生_形成愈伤组织，并进行继代培养。用含重组质粒的农杆菌侵染愈伤组织，再培养愈伤组织，以便获得抗虫的转基因水稻。影响愈伤组织能否成功再生出植株的因素有：培养条件如光温、培养基配方如植物激素配比、以及_ _ (答出2点即可)。,解析 (1)构建重组质粒时限制性核酸内切酶EcoR剪切得到的是粘性末端，DNA连接酶连接两个DNA片段之间形
3、成的是磷酸二酯键。 (2)目的基因导入植物细胞常用农杆菌转化法。用Ca2处理细菌以增加细菌细胞壁的通透性，让其处于感受态细胞，以利于重组质粒导入。 (3)不同种类植物或同种植物的不同基因型个体之间存在遗传的差异，细胞全能性的表达程度大小不同，小麦水稻等作物在多次继代培养后，会丧失细胞全能性的表达能力。 答案 (1)粘性末端 磷酸二酯键 (2)转化 使CaCl2处理过的农杆菌恢复细胞的正常状态 (3)消毒 脱分化 水稻的基因型、愈伤组织继代的次数,2.(2017浙江11月选考)回答与植物克隆和动物克隆有关的问题：(1)利用植物愈伤组织获得再生植株主要有两条途径：一是由愈伤组织的细胞先分化产生芽和
4、根后再形成一个完整植株的_途径，二是由愈伤组织细胞产生胚状体后再萌发形成完整植株的胚胎发生途径。另外也可不通过愈伤组织阶段而直接采用带腋芽的茎段培养成丛状苗，再诱导生根获得再生植株，其原因是腋芽中存在_。,(2)利用植物克隆培育新品种，一方面可利用带有目的基因的_侵染植株，或将目的基因通过_的方法导入植物细胞、组织或器官获得转基因植株，另一方面利用异源植株的_进行融合产生杂种植株，或利用异源植物在试管内进行_，对其产生的胚进行培养产生杂种植株。 (3)下列属于植物克隆和动物克隆共有的培养方法是_。 A.悬浮培养、器官培养 B.贴壁培养、传代培养 C.器官培养、愈伤组织培养 D.原生质体培养、传
5、代培养,解析 (1)外植体经脱分化后形成愈伤组织，由愈伤组织形成再生植株主要有两条途径：一是由愈伤组织的细胞先分化产生芽和根后再形成一个完整植株是植物组织培养的器官发生途径，二是由愈伤组织的细胞产生胚状体后再萌发成完整植株是植物组织培养的胚胎发生途径。不通过愈伤组织阶段而直接采用带腋芽的茎段培养成丛状苗，这说明腋芽中含有分生组织，而分生组织中含较高的细胞分裂素，细胞分裂素与生长素之比较高可促进芽的生长。 (2)将目的基因导入植物细胞，可以用含有目的基因的农杆菌直接侵染，或者用显微注射法导入；用异源植物可以利用植物体细胞杂交技术或者受精之后的胚胎进行培养，也可以获得杂种植株。,(3)贴壁生长是动
6、物细胞培养时的特性；愈伤组织是指植物细胞在组织培养过程中形成的一种排列疏松而无规则的无定形状态、高度液泡化的薄壁细胞，动物细胞无愈伤组织培养；传代培养应用于动物细胞培养过程中。 答案 (1)器官发生 分生组织 (2)农杆菌 显微注射 原生质体 受精 (3)A,3.(2016浙江10月选考节选)某小组欲进行烟草原生质体分离与培养的研究。请回答：(1)原生质体的分离：在无菌条件下，取烟草无菌苗的叶片，放入含有0.5mol/L甘露醇(维持较高渗透压)的_混合液处理，经过离心纯化后获得原生质体。(2)原生质体的培养：将原生质体进行培养，重新长出细胞壁，形成胚性细胞。此时，应该_培养基中甘露醇浓度，以利
7、于胚性细胞继续培养形成细胞团，然后经两条途径形成再生植株。途径一：细胞团经球形胚、_和胚状体，最后发育成植株。途径二：细胞团增殖为愈伤组织，然后在发芽培养基上诱导出芽，切割芽经过生根后形成完整植株。上述发芽培养基中含量相对较高的激素是_，胚性细胞的主要特点是_(A.液泡小、细胞核小 B.液泡大，细胞核大 C.液泡大，细胞核小 D.液泡小、细胞核大)。,(3)为了对烟草的某些性状进行改良，分离两种烟草的原生质体后，通过_方法将他们的遗传物质组合在一起，经培养获得具有新性状的再生植株。提取再生植株的DNA，采用_扩增相关基因，来鉴定遗传物质是否成功重组。,解析 (1)去除植物细胞壁，获得植物细胞的
8、原生质体，常用的方法是利用纤维素酶和果胶酶处理植物细胞。(2)在获取原生质体时甘露醇是作为维持细胞膜内外渗透压平衡的稳定剂使用的。其具体作用是提高渗透压，防止水分渗入细胞内部，造成细胞破裂。在原生质体形成新细胞壁后，有细胞壁支持与保护作用，所以要稀释甘露醇的浓度；从胚性细胞细胞团球形胚心形胚胚状体，然后再生出完整的小植株；为快速诱导芽的分化，培养基中往往添加细胞分裂素；胚性细胞的特点是液泡小、细胞核大。(4)植物细胞工程中，利用原生质体融合的方法获得杂种细胞；体外扩增DNA技术常用的是多聚酶链式反应，即PCR技术。 答案 (1)纤维素酶和果胶酶 (2)稀释(降低) 心形胚 细胞分裂素 D (3
9、)原生质体融合 PCR,4.(2016浙江4月选考节选)兔肝细胞中的基因E编码代谢甲醛的酶，拟利用基因工程技术将基因E转入矮牵牛中，以提高矮牵牛对甲醛的代谢能力。请回答：(1)从兔肝细胞中提取mRNA，在_酶的作用下形成互补的DNA，然后以此DNA为模板扩增得到基因E。在相关酶的作用下，将基因E与Ti质粒连接在一起，形成_，再导入用氯化钙处理的_，浸染矮牵牛叶片。将被浸染的叶片除菌后进行培养，最终得到转基因矮牵牛。其中培养过程正确的是_(A.叶片在含合适浓度生长素的培养基上分化形成愈伤组织 B.愈伤组织在含细胞分裂素和生长素配比较高的培养基上形成芽 C.再生的芽在细胞分裂素含量高的培养基上生根
10、 D.愈伤组织在含合适浓度植物生长调节剂的培养基上脱分化形成再生植株)。,(2)取转基因矮牵牛叶片，放入含MS液体培养基和适量浓度甲醛且密封的试管中。将试管置于_上，进行液体悬浮培养。一段时间后测定培养基中甲醛的含量，以判断基因E是否在转基因矮牵牛中正常表达。培养过程中液体培养基的作用：一是提供营养；二是_，从而使叶片保持正常的形态。,解析 (1)以mRNA为模板合成DNA的过程为逆转录过程，这一过程需要在逆转录酶的催化下进行。获得目的基因后，需在限制性核酸内切酶和DNA连接酶的作用下，将目的基因与运载体(Ti质粒)连接形成重组质粒(重组DNA分子)，再将其导入受体细胞。将目的基因导入植物细胞
11、常用农杆菌转化法，先将重组DNA导入经氯化钙处理的农杆菌，再用导入目的基因的农杆菌感染植物细胞，最终实现将目的基因导入植物细胞内。导入目的基因的植物细胞经组织培养过程形成转基因植物。组织培养过程中，叶片在含适宜浓度的生长素的培养基上脱分化形成愈伤组织，然后在含细胞分裂素和生长素配比较高的培养基上形成芽，继而在生长素含量高的培养基上生根，最后形成完整的植株，愈伤组织形成植株的过程中发生细胞的分化。(2)植物组织培养过程中，将愈伤组织等细胞置于摇床上，进行液体悬浮培养，形成多个分散的细胞。培养过程中培养液一方面为植物细胞提供营养，另一方面维持一定的渗透压，从而使叶片保持正常的形态。 答案 (1)逆
12、转录 重组DNA分子 农杆菌 B (2)摇床 维持渗透压,1.正误判断(1)基因工程的载体有质粒、噬菌体、动植物病毒，其中噬菌体可将外源基因载入动物细胞内。( )(2)构建重组DNA分子时必须使用同种限制性核酸内切酶切割目的基因和载体DNA，以在目的基因和载体DNA的两端形成相同的粘性末端。( )(3)转入了人胰岛素原基因的大肠杆菌，可以合成出具有生物活性的胰岛素。( )(4)转基因技术育种克服了传统育种的育种时间长、远缘亲本难以杂交的缺陷。( ),(5)植物克隆的技术基础是植物的细胞和组织培养，其理论基础是植物细胞的全能性。( ) (6)动物克隆的技术基础是动物的细胞和组织培养，其理论基础是
13、动物细胞的全能性。( ) (7)细胞克隆的要求必须保证分离出来的细胞是一个或多个分离的细胞。( ) (8)细胞系是泛指可传代的细胞，细胞株是具有特殊性质的细胞系。( ),2.读图析图 (1)的构建需要_酶参与。(2)过程依据的原理是_，关键步骤包括_。(3)要确定抗虫基因导入植物细胞后，是否赋予了植物抗虫特性，在个体水平上还需要做_实验；若要检测具有抗虫基因的棉花是否产生了相应毒蛋白，在分子水平上可利用_方法进行检测。提示 (1)限制性核酸内切酶和DNA连接 (2)植物细胞的全能性 脱分化、再分化 (3)抗虫接种 抗原抗体杂交,考点1 基因工程的工具 1.已知一双链DNA分子，用限制性核酸内切
14、酶切割得到长度为120 kb(kb：千碱基对)片段；用限制性核酸内切酶切割得到40 kb和80 kb两个片段；同时用限制性核酸内切酶和限制性核酸内切酶切割时，得到10 kb、80 kb和30 kb 3个片段。据此分析该双链DNA分子结构及酶切位点情况为( ),解析 根据题意，该DNA用限制性核酸内切酶切割后得1条片段，故为环状DNA，根据两酶的作用结果，可知酶切图谱为D。 答案 D,2.某一质粒载体如图所示，外源DNA插入Ampr或Tetr中会导致相应的基因失活(Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因)。有人将此质粒载体用BamH酶切后，与用BamH酶切获得的目的基因混合，
15、加入DNA连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化大肠杆菌，结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化。被转化的大肠杆菌有三种，分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。回答下列问题：,如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选，在上述四种大肠杆菌细胞中，未被转化的和仅含环状目的基因的细胞是不能区分的，其原因是_ _； 并且_和_的细胞也是不能区分的，其原因是_ _。 在上述筛选的基础上，若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌单菌落，还需使用含有_的固体培养基。,解析 未转化的和仅含环状目的基因的细胞都不能在含有氨苄青霉素的培养基上生长，故这两种不可区分。含有
16、质粒载体和含有插入了目的基因的重组质粒的细胞在含有氨苄青霉素的培养基上都能生长，这两种也不可区分。因目的基因插入位点在四环素抗性基因上，四环素抗性基因被破坏，在获得的单个菌落中各挑取少许分别接种到含有四环素的培养基上，不能生长的为要筛选的菌落，即含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。 答案 二者均不含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均不生长 含有质粒载体 含有重组质粒 二者均含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均能生长 四环素,质粒上的抗生素抗性基因的作用 用作基因工程载体的质粒一般含有一些抗生素抗性基因(如青霉素抗性基因、四环素抗性基因等)，供重组DNA分子的鉴定和筛选。通常情况下，受体
17、细胞自身没有抵抗相关抗生素的能力，当含有抗生素抗性基因的质粒与目的基因构建形成的重组DNA分子导入受体细胞后，抗生素抗性基因在受体细胞中表达，使受体细胞能够抵抗相应抗生素，从而在受体细胞的培养基中加入该种抗生素，就可以淘汰未导入重组DNA分子的受体细胞，保留导入了重组DNA分子的受体细胞。,考点2 基因工程的原理、技术和应用 3.(2018嘉兴3月选考测试)丝素蛋白是家蚕的一种分泌性复合蛋白，由丝素蛋白重链(FibH)、丝素蛋白轻链(Fibl)和P25糖蛋白组成。将Fibl基因导入大肠杆菌(不含质粒A)并实现表达的过程如图所示。,(1)构建重组质粒时要用到的工具酶是_。 (2)导入时，为了增加
18、大肠杆菌的通透性，常用_处理大肠杆菌。 (3)接种在含氨苄青霉素培养基上的大肠杆菌，有的不能形成菌落，原因是_。 (4)影印接种就是用丝绒做成与平板大小相近的印章，然后把长有菌落的母平板倒置在丝绒印章上，轻轻印一下，再把此印章在新的培养基平板上轻轻印一下。经培养后，比较新平板上长出的菌落与母平板上的菌落位置，推测可能导入了重组质粒的菌落是_(用字母表示)。 (5)目的基因成功表达的标志是_。,解析 重组质粒的构建过程：通常先用相同的限制性核酸内切酶分别切割目的基因和质粒，然后用DNA连接酶将目的基因和质粒连接。将重组质粒导入大肠杆菌时，因成功率问题，大肠杆菌有四种可能：导入了重组质粒(可在含氨
19、苄青霉素培养基上生长，但不能在含四环素培养基上生长)、导入了质粒(既能在含氨苄青霉素培养基上生长，也能在含四环素培养基上生长)、导入了环状目的基因或未转化(既不能在含氨苄青霉素培养基上生长，也不能在含四环素培养基上生长)。 答案 (1)限制性核酸内切酶和DNA连接酶 (2)氯化钙 (3)没有导入质粒或重组质粒 (4) b、c (5)大肠杆菌合成丝素蛋白轻链(Fibl),4.人血清蛋白(HSA)具有重要的医用价值。下图是以基因工程技术获取重组HSA(rHSA)的两条途径。 (1)如果HSA基因序列未知，可以采用_的方法获取该目的基因，为了使目的基因能够在宿主细胞中复制和稳定保存，通常要先构建_后
20、才能导入宿主细胞。(2)方框中的“？”一般选用的生物是_，为了提高过程的导入成功率，通常用_处理大肠杆菌。,(3)人体合成的初始HSA多肽，需要经过膜系统加工形成正确的空间结构才能有活性，所以选择_途径(填或)获取rHSA更有优势。 (4)为了鉴定宿主细胞中是否产生rHSA，可以用_方法来进行检验。 A.检验HSA基因是否导入 B.检验细胞中是否产生相应的mRNA C.抗原抗体杂交 D.检测是否有标记基因,解析 (1)若目的基因序列已知，可用化学方法合成目的基因或用PCR技术扩增目的基因；若目的基因序列未知，可从基因文库中获取。目的基因不能够直接导入受体细胞，而是必须与载体构建重组DNA分子后
21、再导入，以使目的基因能够在宿主细胞中复制和稳定保存。(2)如果受体细胞是植物细胞，一般选用农杆菌转化法导入目的基因；为增加大肠杆菌细胞壁的通透性，利于目的基因导入，需用氯化钙处理大肠杆菌。(3)大肠杆菌属于原核生物，细胞内缺少内质网、高尔基体，无法对合成的初始HSA多肽进行加工。(4)rHSA是一种抗原蛋白，可以利用相应的抗体进行检测。 答案 (1)从基因文库中提取 重组DNA分子 (2)农杆菌 氯化钙 (3) (4)C,基因工程操作的“五步曲” (1)获取目的基因 若目的基因的序列已知，可用化学方法合成或用PCR扩增；若目的基因的序列未知，可从基因文库中分离。,(2)形成重组DNA分子 通常
22、是用相同的限制性核酸内切酶分别切割目的基因和载体DNA，形成相同粘性末端，然后用DNA连接酶将目的基因和载体DNA连接形成重组DNA分子(如下图)。但在实际操作中，可形成3种不同的连接物：目的基因载体连接物、载体载体连接物、目的基因目的基因连接物。,因为同种限制性核酸内切酶切割目的基因和载体DNA所得粘性末端全部相同，在DNA连接酶的作用下，目的基因和载体DNA则可任意连接。为了使目的基因与质粒能定向连接，可使用两种不同的限制性核酸内切酶切割目的基因和质粒(如下图)。,(3)将重组DNA分子导入受体细胞,(4)筛选含有目的基因的受体细胞 筛选原因：并不是所有的细胞都接纳了重组DNA分子，还有部
23、分细胞接纳了载体载体连接物、目的基因目的基因连接物，甚至有的细胞既没有接纳重组DNA分子，也没有接纳载体载体连接物、目的基因目的基因连接物。 筛选方法：主要是利用载体上的抗生素抗性基因的作用借助一定方法(如影印接种)用选择培养基筛选。 (5)目的基因的表达 若目的基因成功表达，则转基因生物细胞中会产生相应的蛋白质(可用抗原抗体法检测)，转基因生物会表现相应的性状(如可接种病原体观察转基因生物的抗性)。,考点3 结合植物的克隆考查科学实践能力 5.下面是关于植物克隆的问题。请回答： (1)为培育能高效吸收和富集重金属镉的转基因植物，将野外采得的某植物幼叶消毒后，用酶混合液处理，获得了原生质体。酶
24、混合液中含有适宜浓度的甘露醇，其作用是_。 (2)将目的基因导入到原生质体，经培养形成愈伤组织，再通过_得到分散的胚性细胞，发育成_，生长发育后获得转基因植株。,(3)愈伤组织继代次数过多会丧失细胞全能性的表达能力，下列原因错误的是_。 A.愈伤组织发生染色体畸变 B.愈伤组织不能分散成单细胞 C.愈伤组织中激素平衡发生改变 D.愈伤组织对外源激素敏感性发生改变,解析 (1)甘露醇可以维持溶液的渗透压，以防止失去细胞壁的原生质体吸水胀破。 (2)将愈伤组织放在摇床上，通过液体悬浮培养可以得到分散的单细胞，这些单细胞具有细胞质丰富、液泡小、细胞核大等胚性细胞的特征，胚性细胞发育成胚状体，进一步形
25、成植株。(3)在长期的培养过程中，愈伤组织可能发生染色体畸变、内部激素平衡改变、对外源激素敏感性改变等变化，而丧失细胞全能性的表达能力。 答案 (1)维持渗透压 (2)液体悬浮培养 胚状体 (3)B,6.植物叶肉细胞原生质体的分离和培养的主要过程可用下图所示图解简单表示，请据图回答下列问题： (1)培育胚状体利用了_这一项生物技术，胚状体再继续培养，则可培育出完整的植株，这体现了植物细胞的_。(2)要获得植物叶肉细胞的原生质体，需要在_溶液环境下，用_酶和_酶去除细胞壁。,(3)培养基中除了含有一定的营养外，还必须含有_等植物激素，还需要对培养基进行严格的_。 (4)如果愈伤组织是三七叶肉细胞
26、培养产生的，为了获得三七的次生代谢产物，则只需要培养到_。如果愈伤组织是棉花叶肉细胞培养产生的，通过基因工程要获取抗虫棉，重组DNA分子导入棉花愈伤组织细胞常用的方法是_法。 (5)从叶片的叶肉细胞到获得胚状体的过程中，必须要经过_(不定项选择：A.有丝分裂 B.减数分裂 C.原生质体融合 D.脱分化 E.再分化)。,解析 (1)离体植物细胞通过脱分化形成愈伤组织，通过再分化形成具有根和芽的胚状体，再通过细胞分裂、分化发育成一个完整的植株。该技术称为植物组织培养，其原理为植物细胞的全能性。(2)制备叶片原生质体的酶混合液中，一般含较高浓度的甘露醇，其目的是避免制备的原生质体吸水胀破；根据酶的专
27、一性，去除植物细胞壁需用纤维素酶和果胶酶。(3)培养基的成分包括水、无机盐、维生素、氨基酸、蔗糖、植物激素(生长素和细胞分裂素等)等；培养基要求进行严格的灭菌。(4)三七的细胞产物为细胞的代谢产物，将三七叶肉细胞培养到愈伤组织即可；目的基因导入植物细胞常用农杆菌转化法。(5)离体叶肉细胞培养到胚状体的过程中必须经过脱分化和有丝分裂形成愈伤组织，再分化和有丝分裂形成胚状体。 答案 (1)植物组织培养 全能性 (2)0.50.6 mol/L的甘露醇 纤维素 果胶 (3)细胞分裂素、生长素 灭菌 (4)愈伤组织 农杆菌转化 (5)ADE,植物细胞培养、器官培养和原生质体培养统称为植物组织培养，最终都
28、能得到完整植株，但由于培养目的不同，有时需对愈伤组织进行特殊处理。它们之间的关系如图所示：,考点4 动物的克隆 7.(2018浙江“超级全能生”联考)如图表示动物细胞克隆和制备单克隆抗体的相关过程，请回答相关问题：,(1)过程常应用_方法导入重组诱导基因后得到干细胞；部分干细胞经过诱导可分化成全身的不同组织或器官，说明这些细胞具有_性。 (2)该过程利用了甲细胞具有的_能力，甲和乙细胞可经过生物诱导剂_的作用形成丙细胞。取一个丙细胞，放在含大量失去_的小鼠成纤维细胞的特定培养体系中培养，最后产生大量的细胞群，这种方法为_法。 (3)下列关于经和过程得到单克隆抗体的叙述，错误的是( ) A.该过
29、程应用了细胞膜具有流动性的原理 B.丙细胞要具有分泌多种抗体的能力 C.该过程应用了动物细胞融合和动物细胞培养技术 D.丙细胞的形成先通过筛选得到杂交瘤细胞，再进行抗体检验 答案 (1)显微注射 发育全能 (2)连续增殖 (灭活的)仙台病毒 增殖力 克隆培养 (3)B,8.(2018金丽衢十二校联考)生物技术已经渗入到了我们生活的方方面面。请回答下列有关动物细胞培养的相关问题：(1)动物细胞培养的原理是_，需要将培养瓶放入_培养。(2)培养过程中需要用胰蛋白酶消化组织中的_。(3)传代培养得到的细胞系往往具有_核型。关于细胞系和细胞株下列说法错误的是_(A.原代培养得到的细胞也可以是细胞系 B.细胞株是特殊的细胞系 C.连续细胞系都获得了不死性 D.连续细胞系不一定都发生了转化)。 (4)细胞克隆又称为克隆培养法，它的最主要用途之一就是从普通细胞系中分离出_的突变细胞系。答案 (1)细胞增殖 CO2培养箱 (2)胶原纤维 (3)异倍体 D (4)缺乏特殊基因,(1)原代培养、传代培养,(2)细胞株、细胞系,(3)单克隆抗体制备中的两次筛选,
