1、第13讲 微生物的培养、分离及酶的应用,考试要求 1.大肠杆菌的培养和分离。2.分离以尿素为氮源的微生物。3.果汁中的果胶和果胶酶。4.淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的检测。,1.(2018浙江11月选考节选)回答与微生物培养及应用有关的问题：(1)对培养基进行高压蒸汽灭菌时，灭菌时间应从_时开始计时。对于不耐热的液体培养基，一般可将其转入G6玻璃砂漏斗中，采用_方式可较快地进行过滤灭菌。(2)与酿造果醋相比，利用大米、高粱等富含淀粉的原料制醋，需增加_的过程。某醋化醋杆菌培养基由蛋白质胨、酵母提取物和甘露醇组成，其中某露醇的主要作用是_。,(3)为筛选胞外淀粉酶分泌型菌种，一般从_(A.果园树
2、下 B.肉类加工厂周围 C.米酒厂周围 D.枯树周围)获得土样，用无菌水稀释，涂布到含有淀粉的选择培养基上培养，一段时间后在培养基表面滴加碘液，可在菌落周围观察到透明的水解圈。若要筛选酶活性较高的菌种，需挑选若干个_比值大的菌落，分别利用液体培养基振荡培养进行扩增。然后将培养液离心，取_用于检测酶活性。,解析 (1)由于高压蒸汽灭菌锅的升温升压需要一定时间，而未达设定温度和压力将导致灭菌不彻底，因此对培养基进行高压蒸汽灭菌时，灭菌时间应从达到设定的温度或压力值时开始计时。对于不耐热的液体培养基，如尿素培养基，一般可将其转入G6玻璃砂漏斗中过滤灭菌，采用抽滤方式可加快过滤速度。(2)相比果醋制作
3、中先利用葡萄糖进行酒精发酵，再进行醋酸发酵，以淀粉为原料制醋，需增加淀粉分解成糖的过程。醋化醋杆菌培养基由蛋白胨、酵母提取物和甘露醇组成，其中甘露醇的主要作用是作为碳源。,(3)结合生物具有适应性的规律，米酒厂周围的淀粉量相对较多，因此存在可分泌淀粉酶的分泌型菌种。分泌的淀粉酶活性越高，数量越多，菌落周围的透明水解圈越大。由于水解圈越大，表明淀粉分解量越多，因此水解圈直径与菌落直径比值大的菌落，分泌的酶活性较高。经液体培养基振荡培养进行扩增后，再将培养液离心，菌种会分布于沉淀，而分泌的胞外酶分布于上清液，可取上清液测定酶活性。 答案 (1)达到设定的温度或压力值 抽滤 (2)将淀粉分解成糖 作
4、为碳源 (3)C 水解圈直径与菌落直径 上清液,2.(2018浙江4月选考节选)回答与果胶、淀粉等提取和利用有关的问题：某植物富含果胶、淀粉、蛋白质和纤维素成分。某小组开展了该植物综合利用的研究。(1)果胶提取工艺研究结果表明，原料先经过一段时间沸水漂洗的果胶得率(提取得到的果胶占原料质量的百分率)显著高于常温水漂洗的果胶得率，最主要原因是沸水漂洗_(A.有助于清洗杂质和去除可溶性糖B.使植物组织变得松散C.使有关酶失活D.有利于细胞破裂和原料粉碎制浆)。,(2)在淀粉分离生产工艺研究中，为促进淀粉絮凝沉降，添加生物絮凝剂(乳酸菌菌液)，其菌株起重要作用。为了消除絮凝剂中的杂菌，通常将生产上使
5、用的菌液，采用_，进行单菌落分离，然后将其_，并进行特性鉴定，筛选得到纯的菌株。 (3)在用以上提取过果胶和淀粉后的剩渣加工饮料工艺研究中，将剩渣制成的汁液经蛋白酶和纤维素酶彻底酶解处理后，发现仍存在浑浊和沉淀问题。可添加_使果胶彻底分解成半乳糖醛酸，再添加_，以解决汁液浑浊和沉淀问题。,(4)在建立和优化固定化酶反应器连续生产工艺研究中，通常要分析汁液中各种成分的浓度和所用酶的活性，然后主要优化各固定化酶反应器中的_(答出2点即可)、反应pH和酶反应时间等因素。其中，酶反应时间可通过_来调节。,解析 本题考查选修一酶的应用，试题侧重与社会生产中利用酶的相关内容结合。果胶酶活性受温度、pH或酶
6、抑制剂的影响。固定化酶就是将水溶性的酶用物理或化学的方法固定在某种介质(如石英砂)上，使之成为不溶于水而又有酶活性的制剂。常用方法有吸附法、共价偶联法等。 答案 (1)C (2)划线分离法(或涂布分离法) 扩大培养 (3)果胶酶和果胶甲酯酶 淀粉酶使淀粉分解 (4)固定化酶的量、反应液温度 控制反应器液体流量(或体积),3.(2017浙江4月选考节选)制作泡菜时，为缩短发酵周期，腌制前可加入乳酸菌。取少量酸奶，用无菌蒸馏水稀释后，再用_蘸取少量的稀释液，在MRS乳酸菌专用培养基的平板上划线，以获得乳酸菌单菌落。下图所示的划线分离操作，正确的是_。,解析 取少量酸奶，用无菌蒸馏水稀释后，再用接种
7、环蘸取少量的稀释液，在MRS乳酸菌专用培养基的平板上划线，以获得乳酸菌单菌落。划线分离法从第二次开始每次都是从上一次划线的末端开始划线，因为线条末端细菌的数目比线条起始处要少，正确的是B。 答案 接种环 B,4.(2016浙江10月选考节选)请回答从土壤中分离产脲酶细菌实验的有关问题：(1)LB固体培养基：取适量的蛋白胨、酵母提取液、NaCl，加入一定的量的蒸馏水溶解，再加_，灭菌备用。(2)尿素固体培养基：先将适宜浓度的尿素溶液，用_灭菌过的G6玻璃砂漏斗过滤，因为G6玻璃砂漏斗_，故用于过滤除菌，然后将尿素溶液加入到已经灭菌的含有酚红的培养基中，备用。,(3)取适量含产脲酶细菌的104、1
8、05两种土壤稀释液，分别涂布接种到LB固体培养基和尿素固体培养基上，培养48小时，推测固体培养基上生长的菌落数最少的是_(A.105稀释液尿素固体培养基 B.105稀释液LB固体培养基 C.104稀释液尿素固体培养基 D.104稀释液LB固体培养基)。在尿素固体培养基上产脲酶细菌菌落周围出现_，其原因是细菌产生的脲酶催化尿素分解产生_所致。 (4)制备固定化脲酶时，用石英砂吸附脲酶，装柱，用蒸馏水洗涤固定化酶柱，其作用为_。 答案 (1)琼脂糖 (2)高压蒸汽 孔径小，细菌不能滤过 (3)A 红色环 氨 (4)除去游离的脲酶,5.(2016浙江4月选考节选)请回答与“果汁中的果胶和果胶酶”实验
9、有关的问题：(1)果胶是细胞壁的重要组成成分，其化学本质是_(A.蛋白质 B.脂质 C.核酸 D.多糖)。它在细胞壁的形成过程中的主要作用是将相邻的细胞_在一起。(2)制取果汁时，先用果胶酶将果胶分解成_和半乳糖醛酸甲酯等物质，再用_酶处理，可得到比较澄清的果汁。用适量且浓度适宜的上述两种酶处理时，果汁的出汁率、澄清度与酶的_高低呈正相关。,(3)由于果胶不溶于乙醇，故可用乙醇对果胶粗提物(经酶处理后的混合物)进行_处理，从而得到干制品。 答案 (1)D 粘合 (2)半乳糖醛酸 果胶甲酯 活性 (3)沉淀,1.正误判断(1)单菌落的常用分离方法有划线分离法和涂布分离法，其中前者操作简单，且可计
10、数菌体数目。( )(2)在划线操作的第一次划线以及之后每次划线之前都要灼烧接种环，在每次划线操作结束后，也需要灼烧接种环。 ( )(3)倒平板时将培养皿的盖拿开，以方便将锥形瓶中的培养基倒入培养皿。 ( )(4)筛选分解尿素的细菌的培养基以尿素为唯一氮源，且为琼脂固体培养基。 ( ),(5)果胶由半乳糖醛酸和半乳糖醛酸甲酯组成，果胶酶和果胶甲酯酶均可水解果胶。( ) (6)将果胶酶用于果汁的生产，既能提高出汁率又能提高果汁的澄清度。( ) (7)教材上淀粉酶固定在石英砂上，固定方法为吸附法。( ) (8)酶的固定化方法有吸附法、共价偶联法、交联法和包埋法等，将酶加上糖衣做成胶囊属于包埋法。(
11、),2.读图析图下图是微生物划线分离示意图，划线的顺序是1、2、3、4、5。 图示划线操作共需灼烧接种环_次。第一次灼烧接种环的目的是_，最后一次灼烧接种环的目的是_，中间几次灼烧接种环的目的是_。,提示 6 避免接种环上可能存在的微生物污染菌种 及时杀死接种环上残留的菌种，避免菌种污染环境和感染操作者 杀死上一次划线结束后接种环上残留的菌种，使下一次划线时接种环上的菌种直接来源于上一次划线的末端,考点1 结合大肠杆菌的培养和分离考查科学实践能力 1.下图为“大肠杆菌的培养和分离”实验的基本流程： 请回答：(1)培养基灭菌常用_法，灭菌后，要待_时才能打开锅盖。(2)倒平板和接种前要用_擦手。
12、接种和划线前使用_的方法对接种环灭菌。,(3)划线分离时，接种环在菌液中蘸取_次。下图甲表示在平板培养基上的第一次和第二次划线，请在乙图中画出第三次划线。 (4)划线后在恒温培养箱中培养时，培养皿须倒置，目的是_ _。 (5)实验完成后，接触过细菌的器皿应如何处理？ _ _。,解析 此题考查大肠杆菌的培养和分离过程，具体分析如下：(1)对培养基进行的灭菌应该是用灭菌锅进行高压蒸汽灭菌。灭菌后，灭菌锅内的压力与大气压相同时，才能打开锅盖，否则会造成培养液溅出。(2)在进行实验操作时，操作者的双手要用酒精棉球擦拭消毒，接种环要用火焰灼烧灭菌。(3)划线分离时，接种环在菌液中蘸取菌液1次然后连续划线
13、。(4)在培养时，培养皿须倒置，目的是防止冷凝后形成的水滴落在培养基上污染培养基，冲散菌落。(5)实验完成后，接触过细菌的器皿应灭菌处理以防止污染。,答案 (1)高压蒸汽灭菌 灭菌锅内压力与大气压相同 (2)酒精棉球 (酒精灯火焰上)灼烧 (3)1 (见下图) (4)防止冷凝后形成的水滴落在培养基上污染培养基 (5)接触过细菌的器皿应作灭菌处理,(1)常见无菌操作技术 提醒：为防止葡萄糖高温分解碳化，含有葡萄糖的培养基要用500 g/cm2压力 (90 以上)灭菌30 min。尿素等加热会分解的物质，不能加热灭菌，只能用G6玻璃砂漏斗过滤。,(2)微生物分离的两种常用方法,考点2 围绕分离以尿
14、素为氮源的微生物考查科学实践能力 2.下图是“分离以尿素为氮源的微生物”实验的基本流程，请回答下列问题：,(1)该实验培养基不能含有_(A.尿素 B.氯化钠 C.葡萄糖 D.琼脂)。 (2)尿素溶液可用_使之无菌。若要检查B过程灭菌是否彻底，可以采用的方法是_ _。 (3)图中步骤C为_。相对于划线分离法，过程D涂布分离法的优点是_。 (4)如果菌落周围出现_色环带，说明该菌落能分泌脲酶。,解析 (1)分离以尿素为氮源的微生物，应该以尿素为唯一氮源，所以不应有琼脂，因为琼脂是未被纯化的混合物，内含一定量的含氮化合物。(2)尿素加热分解，不能够加热灭菌，只能用G6玻璃砂漏斗过滤除去细菌等微生物。
15、将空白培养基放在适宜温度下培养一段时间，若无菌落出现，则说明培养基灭菌彻底。(3)图中步骤C为倒平板，相对于划线分离法，涂布分离法更容易获得单菌落。(4)若菌落能分泌脲酶，则菌落周围会出现红色环带。 答案 (1)D (2)G6玻璃砂漏斗过滤 将空白培养基放在适宜温度下培养一段时间，观察有无菌落出现 (3)倒平板 单菌落更易分开 (4)红,(1)本实验用琼脂糖代替琼脂配制固体培养基。琼脂是未被纯化的混合物，内含一定量的含氮化合物，不利于以尿素为氮源的细菌的筛选。 (2)因尿素加热分解，本实验配制尿素固体培养基时，需先高压蒸汽灭菌，冷却至 60 时再加入通过G6玻璃砂漏斗过滤的尿素溶液。 (3)微
16、生物筛选过程中必要的两种对照培养基及其作用 筛选微生物时，除选择培养基外，还需设置两组对照培养基，以提高实验的说服力和科学性。,考点3 结合果汁中的果胶和果胶酶考查科学实践能力 3.(2018学军中学3月模拟)回答下列有关果胶、果汁和果胶酶等问题。(1)果胶是植物细胞壁的主要成分，起着将植物细胞_在一起的作用。制作果汁时可加入果胶酶和_以分解果胶，提高果汁出汁率和澄清度。(2)生产果胶酶可从黑曲霉中提取，下列适于黑曲霉扩大培养的培养基是_(A.蛋白胨和酵母提取物培养基 B.尿素固体培养基 C.MS培养基 D.添加蔗糖的豆芽汁培养基)。由于果胶酶溶于水，不利于重复使用，可通过物理或化学方法将果胶
17、酶固定在某种介质上，使之成为不溶于水而又有_的制剂。,(3)用果汁制作果酒，以果汁为原料，加入一定比例的蔗糖目的是_。 最后倒入酵母悬液，混匀，加盖；发酵开始时，由于微生物的需氧呼吸会使发酵瓶内出现_，原因是_ _。 解析 “细菌喜荤，霉菌喜素”，霉菌培养基一般用无机物配制或添加蔗糖的豆芽汁即可。用果汁制作果酒时加入一定比例的蔗糖，既可以增加糖的含量，又可以借助酵母菌将蔗糖转化为酒精而提高果酒的酒精含量。 答案 (1)粘合 果胶甲酯酶 (2)D 酶活性 (3)提高果酒的酒精和糖的含量 负压 需氧呼吸消耗氧气，产生的二氧化碳易溶于水,考点4 淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的检测 4.如图是固定化酶
18、反应柱，请回答下列问题： (1)将淀粉酶溶于水中，再加入石英砂，不时搅拌，这样淀粉酶就可以固定在石英砂上。这种固定化酶的方法称为_。30 min后，装入如图所示的反应器中，构成固定化酶反应柱，并用10倍体积的蒸馏水洗涤此反应柱，洗涤的目的是_。洗涤时，蒸馏水流速_(填“能”或“不能”)过快。,(2)实验时，将此反应柱固定在支架上，用滴管滴加可溶性淀粉溶液，并以0.3 mL/min的流速过柱，控制流速的目的是_。 在流出5 mL后接收0.5 mL流出液，加入12滴_，观察颜色。为了使观察到的颜色变化明显，可_后再观察。如果溶液呈红色，说明淀粉水解成为_。 (3)实验后，用10倍柱体积的蒸馏水洗涤
19、此反应柱，洗涤的目的是_。 洗涤后，放置在4 冰箱中保存。几天后，可重复使用。,解析 (1)固定化酶的制作方法有吸附法、共价偶联法、交联法和包埋法，本题所示为吸附法。洗涤的目的是除去未吸附的一些游离的酶，在洗涤时流速不能过快，为1 mL/min。(2)以相对较慢的流速使淀粉溶液流过反应柱，可以让吸附着的酶与底物充分反应。根据KII2溶液与淀粉反应呈蓝色，与糊精反应呈红色的原理来鉴定反应情况。(3)实验完成后还需要对反应柱进行洗涤，以除去参与反应的反应物及生成的产物，以便重复使用。 答案 (1)吸附法 除去未吸附的游离淀粉酶 不能 (2)使淀粉溶液与溶粉酶充分接触充分反应 KII2溶液 稀释 糊精 (3)洗去残留的反应物和产物,(1)固定化酶的优点：酶既能与反应物接触，又能与产物分离，且可被反复多次利用。 (2)两次用10倍体积的蒸馏水洗涤注射器的目的比较,
