1、1第 33 讲 基因工程考纲要求 1.工具酶的发现和基因工程的诞生(a)。2.基因工程的原理和技术(b)。3.基因工程的应用(a)。4.活动：提出生活中的疑难问题，设计用基因工程技术解决的方案(c)。考点一 基因工程的含义及操作工具1.基因工程的诞生(1)概念：基因工程是狭义的遗传工程。广义的遗传工程泛指把一种生物的遗传物质(细胞核、染色体脱氧核糖核酸等)移到另一种生物的细胞中去，并使这种遗传物质所带的遗传信息在受体细胞中表达。(2)核心：构建重组 DNA 分子，早期也将基因工程称为重组 DNA 技术。(3)诞生时间：20 世纪 70 年代。(4)理论基础：DNA 是生物遗传物质的发现，DNA
2、 双螺旋结构的确立以及遗传信息传递方式的认定。(5)技术保障：限制性核酸内切酶、DNA 连接酶和质粒载体的发现和运用。2.基因工程的基本工具归纳总结 与 DNA 有关的酶的比较项目 作用底物 作用部位 形成产物限制性核酸内切酶 DNA 分子 磷酸二酯键 粘性末端或平末端DNA 连接酶 DNA 片段 磷酸二酯键 重组 DNA 分子DNA 聚合酶 脱氧核苷酸 磷酸二酯键 子代 DNADNA 解旋酶 DNA 分子 碱基对间的氢键 形成脱氧核苷酸单链2DNA(水解)酶 DNA 分子 磷酸二酯键 游离的脱氧核苷酸(1)限制性核酸内切酶只能用于切割目的基因( )(2)DNA 连接酶能将两碱基间通过形成的氢
3、键连接起来( )(3)质粒是小型环状 DNA 分子，是基因工程常用的载体( )(4)载体的作用是携带目的基因导入受体细胞中，使之稳定存在并表达( )(5)DNA 连接酶能够将任意 2 个 DNA 片段连接在一起( )观察下图所示过程，回答需要的工具酶及相关问题：(1)是限制性核酸内切酶，是 DNA 连接酶，二者的作用部位都是磷酸二酯键。(2)限制性核酸内切酶不切割自身 DNA 的原因：原核生物中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。(3)说明限制性核酸内切酶有何特性？具有专一性。1.科学家将人的生长激素基因与大肠杆菌的 DNA 分子进行重组，并使其成功地在大肠杆菌中得以表达。但在进行基因工
4、程的操作过程中，需使用特定的限制性核酸内切酶切割目的基因和质粒，便于重组和筛选。已知限制性核酸内切酶的识别序列和切点是G GATCC，限制性核酸内切酶的识别序列和切点是 GATC，据图回答：(1)过程表示的是采用_的方法来获取目的基因。(2)根据图示分析，在形成重组 DNA 分子的过程中，应用限制性核酸内切酶_(填“”或“”)切割质粒，用限制性核酸内切酶_(填“”或“”)切割目的基因。(3)人的基因之所以能与大肠杆菌的 DNA 分子进行重组，原因是_。(4)人体的生长激素基因能在大肠杆菌体内成功表达出人的生长激素是因为_。3写出目的基因导入大肠杆菌中后表达的过程：_。答案 (1)逆转录 (2)
5、 (3)人的基因与大肠杆菌 DNA 分子的双螺旋结构相同 (4)人与细菌共用一套(遗传)密码子 生长激素基因 mRNA 生长激素 转 录 翻 译 解析 (2)根据图示分析可知，目的基因插入了质粒中四环素抗性基因的内部，而该位置有限制性核酸内切酶的识别序列，因此在形成重组 DNA 分子过程中，应用限制性核酸内切酶切割质粒；而目的基因的两侧均含有能被限制性核酸内切酶识别的碱基序列，所以用限制性核酸内切酶切割目的基因。用限制性核酸内切酶切割目的基因和载体后形成的末端按碱基互补配对原则进行连接。(3)人的基因之所以能与大肠杆菌 DNA 分子进行重组，是因为人的基因与大肠杆菌 DNA 分子的双螺旋结构相
6、同。(4)人体的生长激素基因能在大肠杆菌体内成功表达是因为人和大肠杆菌共用一套(遗传)密码子；目的基因导入大肠杆菌中后表达的过程为生长激素基因 mRNA 生长激素。 转 录 翻 译 2.(2018金丽衢十二校联考)下表是几种限制性核酸内切酶识别序列及其切割位点，图 1、图 2 中标注了相关限制性核酸内切酶的酶切位点，其中切割位点相同的酶不重复标注。请回答下列问题：限制酶 BamH Bcl Sau3A Hind识别序列及切割位点GGATCCCCTAGGTGATCAACTAGTGATCCTAGAAGCTTTTCGAA(1)用图中质粒和目的基因构建重组质粒，应选用_两种限制性核酸内切酶切割，酶切后的
7、载体和目的基因片段，通过_酶作用后获得重组质粒。为了扩增重组质粒，需将其转入处于_态的大肠杆菌中。(2)为了筛选出转入了重组质粒的大肠杆菌，应在筛选平板培养基中添加_，平板上长出的菌落，常用 PCR 鉴定，所用的引物组成为图 2 中_。4(3)若 BamH酶切的 DNA 末端与 Bcl酶切的 DNA 末端连接，连接部位的 6 个碱基对序列为_，对于该部位，这两种酶_(填“都能” “都不能”或“只有一种能”)切开。(4)若用 Sau3A切图 1 质粒，最多可能获得_种大小不同的 DNA 片段。(5)基因工程中，某些噬菌体经改造后可以作为载体，其 DNA 复制所需的原料来自_。答案 (1) Bcl
8、和 Hind DNA 连接 感受(2)四环素 引物甲和引物丙(3) 都不能TGATCCACTAGG(或 GGATCACCTAGT)(4)7(5)受体细胞解析 (1)分析 4 种限制性核酸内切酶识别的序列可知： BamH和 Bcl的识别序列中含有Sau3A的识别序列，这三种酶切割 DNA 后可以产生相同的粘性末端。为保证质粒上含有标记基因，切割质粒时不能选用 BamH和 Sau3A，应选用 Bcl和 Hind两种限制性核酸内切酶切割；酶切后的载体和目的基因片段，需用 DNA 连接酶连接形成重组质粒。为了扩增重组质粒，需将其转入处于感受态的大肠杆菌中。(2)重组质粒中四环素抗性基因结构完整，氨苄青
9、霉素抗性基因结构被破坏，在筛选平板培养基中添加四环素可以筛选出转入了重组质粒的大肠杆菌。根据图 2 可知，PCR 扩增该目的基因时，需用引物甲和引物丙两种引物。(3)BamH酶切产生的粘性末端为 和 ， Bcl酶切产生的粘性末端为 和GCCTAG GATCCG GATCAT，经 DNA 连接酶连接后，连接部位的 6 个碱基对序列为 或 ，该部位的TACTAG GGATCACCTAGT TGATCCACTAGG序列不能被 BamH和 Bcl识别，因此不能被这两种酶切开。(4)图 1 质粒中含有 Sau3A酶的 3 个识别序列，如图(A、B、C 分别表示相邻切点间的 DNA 片段)：用 Sau3A
10、酶切，若在一个切点处切割可得到：BCA、CAB、ABC 三种 DNA 片段(但其大小相同)；若在两个切点处切割可得到：A、BC、AC、B、AB、C 六种 DNA 片段(其大小均不同)；若在三个切点处均切割，可得到 A、B、C 三种大小不同的 DNA 片段，综上所述，用 Sau3A酶切质粒最多可能获得 7 种大小不同的 DNA 片段。(5)噬菌体不能独立生活，必需依赖活细胞才能生存，所以噬菌体作为载体时，其 DNA 复制所需的原料来自所导入的受体细胞。5限制性核酸内切酶的选择方法(1)根据目的基因两端的限制性核酸内切酶切点确定限制性核酸内切酶的种类应选择切点位于目的基因两端的限制性核酸内切酶，如
11、图甲可选择 Pst。不能选择切点位于目的基因内部的限制性核酸内切酶，如图甲不能选择 Sma。为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制性核酸内切酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用 Pst和 EcoR两种限制性核酸内切酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切点)。(2)根据质粒的特点确定限制性核酸内切酶的种类所选限制性核酸内切酶要与切割目的基因的限制性核酸内切酶相一致，以确保具有相同的粘性末端(或平末端)。质粒作为载体必须具备标记基因等，所以所选择的限制性核酸内切酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中限制性核酸内切酶 Sma会破坏标记基因；如果所选酶的切点不只一个，则切割重组后可能丢失
12、某些片段，若丢失的片段含复制原点，则切割重组后的片段进入受体细胞后不能自主复制。考点二 基因工程的基本操作步骤、应用及相关的设计方案1.基因工程的基本操作步骤(1)获得目的基因目的基因序列已知：化学合成或 PCR 扩增；目的基因序列未知：从基因文库中获取。(2)形成重组 DNA 分子(基因工程的核心)：通常用相同的限制性核酸内切酶分别切割目的基因和载体 DNA，然后用 DNA 连接酶将目的基因和载体 DNA 连接在一起，形成重组 DNA 分子。(3)将重组 DNA 分子导入受体细胞常用的受体细胞：大肠杆菌、枯草杆菌、酵母菌和动植物细胞等。导入方法：用氯化钙处理大肠杆菌，可以增加大肠杆菌细胞壁的
13、通透性，使重组质粒容易进入。(4)筛选含有目的基因的受体细胞筛选原因：并不是所有的细胞都接纳了重组 DNA 分子，因此，需筛选含目的基因的受体细6胞。筛选方法：用含抗生素的培养基培养受体细胞，选择含重组质粒的受体细胞。(5)目的基因的表达目的基因在宿主细胞中表达，产生人们需要的功能物质。2.基因工程的应用应用领域 优点转基因植物 所需时间短，克服了远缘亲本难以亲合的缺陷基因工程与遗传育种 转基因动物指转入了外源基因的动物。优点是省时、省力，并能取得一定的经济效益基因工程药物 主要有胰岛素、干扰素和乙型肝炎疫苗等基因工程与疾病治疗 基因治疗向目标细胞中引入正常功能的基因，以纠正或补偿基因的缺陷，
14、达到治疗的目的基因工程与生态环境保护开发可降解的新型塑料；改造分解石油的细菌，提高其分解石油的能力等(1)抗虫基因即使成功地插入到植物细胞染色体上也未必能正常表达( )(2)应 用 DNA 探 针 技 术 ， 可 以 检 测 转 基 因 抗 冻 番 茄 植 株 中 目 的 基 因 的 存 在 及 其 是 否 完 全 表达 ( )(3)将人的干扰素基因重组到质粒后导入大肠杆菌，获得能产生人干扰素的菌株( )(4)利用乳腺生物反应器能够获得一些重要的医药产品，如人的血清白蛋白，这是因为将人的血清白蛋白基因导入了动物的乳腺细胞中( )(5)为培育出抗除草剂的作物新品种，导入抗除草剂基因时只能以受精卵
15、为受体( )7如图为抗虫棉的培育过程，请据图回答下列问题：(1)该基因工程中的目的基因和载体分别是什么？一般情况下，为什么要用同一种限制性核酸内切酶处理目的基因和载体？提示 目的基因是 Bt 毒蛋白基因，载体是 Ti 质粒。用同一种限制性核酸内切酶处理目的基因和载体，可以获得相同的粘性末端，便于形成重组 DNA 分子。(2)该实例中为什么目的基因可以整合到染色体的 DNA 上？提示 由于 Ti 质粒上的 TDNA 可转移到受体细胞且能整合到受体细胞的染色体 DNA 上，而目的基因又插入到了 TDNA 上，所以目的基因可以整合到受体细胞的染色体 DNA 上。(3)该实例中，检测目的基因是否表达常
16、见的方法是什么？提示 用棉叶饲喂棉铃虫。1.三种获取目的基因方法的比较项目 化学合成法 聚合酶链式反应(PCR) 建立基因文库法适用对象 目的基因序列已知 目的基因序列已知 目的基因序列未知过程逆转录法：获取 mRNA合成DNA 单链合成 DNA 双链(目的基因)以单个脱氧核苷酸为原料按照已知 DNA 序列直接人工合成在体外通过酶促反应有选择地大量扩增特定的DNA 片段，即目的基因利用限制性核酸内切酶、DNA 连接酶、质粒等工具建立基因文库筛选出目的基因优缺点专一性强，获取的目的基因较小速度快，以指数方式扩增操作相对简便，但工作量大2.形成重组 DNA 分子通常是采用相同的限制性核酸内切酶分别
17、切割目的基因和载体 DNA(如质粒)，获得相同的粘性末端，在 DNA 连接酶的作用下形成重组质粒，如图 1 所示。但应用此种方式，在实际操作8中目的基因、载体质粒经 DNA 连接酶处理后，获得的产物可能有三种：目的基因与目的基因连接物；质粒与质粒连接物；目的基因与质粒连接物。为了使目的基因与质粒能定向连接，可使用两种不同的限制性核酸内切酶切割目的基因和质粒，然后在 DNA 连接酶的作用下形成重组质粒，如图 2 所示。3.有关基因工程操作易错分析(1)基因文库中的基因保存在受体菌中。(2)原核生物繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少，有利于目的基因的复制与表达，因此常采用大肠杆菌等原核生物作为受
18、体细胞。(3)植物细胞的全能性较高，可经植物组织培养过程成为完整植物体，因此受体细胞可以是受精卵也可以是体细胞；动物基因工程中的受体细胞一般是受精卵。(4)操作工具有三种，但常用工具酶有两种，载体不是酶。在基因工程操作步骤“获得目的基因”和“形成重组 DNA 分子”两个过程中，通常用同种限制性核酸内切酶，目的是产生相同的粘性末端(或平末端)；DNA 连接酶只在“形成重组 DNA 分子”操作中用到。(5)一般情况下，用同一种限制性核酸内切酶切割质粒和含有目的基因的 DNA 片段，但有时可用两种限制性核酸内切酶分别切割质粒和目的基因，这样可避免质粒和质粒之间、目的基因和目的基因之间的连接。(6)标
19、记基因的种类和作用：标记基因的作用筛选、检测目的基因是否导入受体细胞，常见的标记基因有抗生素抗性基因、发光基因(表达产物为带颜色的物质)等。命题点一 基因工程的操作程序1.为了增加菊花花色类型，研究者从其他植物中克隆出花色基因 C(图 1)，拟将其与质粒(图 2)重组，再借助农杆菌导入菊花中。9下列操作与实验目的不符的是( )A.用限制性核酸内切酶 EcoR和连接酶构建重组质粒B.用含 C 基因的农杆菌侵染菊花愈伤组织，将 C 基因导入细胞C.在培养基中添加卡那霉素，筛选被转化的菊花细胞D.用分子杂交技术检测 C 基因是否整合到菊花染色体上答案 C解析 在形成重组 DNA 分子时，为保证目的基
20、因与载体的连接，需要用同种限制性核酸内切酶进行切割产生相同的粘性末端，才能通过 DNA 连接酶连接，图中目的基因的两端和启动子与终止子之间都有限制性核酸内切酶 EcoR的切割位点，因此选用限制性核酸内切酶EcoR切割目的基因和载体，A 正确；菊花为双子叶植物，将目的基因导入双子叶植物细胞的常用方法是农杆菌转化法，B 正确；图 2 中重组质粒中的抗性基因为潮霉素抗性基因，应该在培养基中添加潮霉素，筛选被转化的菊花细胞，C 错误；要检测转基因生物的染色体DNA 上是否插入了目的基因，常用 DNA 分子杂交技术，D 正确。2.在某些深海鱼中发现的抗冻蛋白基因 afp 对提高农作物的抗寒能力有较高的应
21、用价值。如图所示是获得转基因莴苣的技术流程，请据图回答下列问题：(1)获取目的基因的主要途径包括从基因文库中获取和_。(2)过程需要的酶有_、_。(3)重组质粒除了带有抗冻蛋白基因 afp 以外，还必须含有启动子、终止子和_，这样才能构成一个完整的基因表达载体。(4)如果受体细胞 C1是土壤农杆菌，则将目的基因导入它的目的是利用农杆菌的_，使目的基因进入受体细胞 C2，并将其插入到受体细胞 C2中的_上，使目的基因的遗传特性得以稳定维持和表达，形成转基因莴苣。10答案 (1)化学方法合成 (2)限制性核酸内切酶 DNA 连接酶 (3)抗生素抗性基因(或标记基因) (4)转化作用 染色体 DNA
22、解析 (1)获取目的基因的主要途径有从基因文库中获取和化学方法合成。(2)过程为形成重组 DNA 分子，需要用到限制性核酸内切酶和 DNA 连接酶。(3)一个完整的重组 DNA 分子包括目的基因、启动子、终止子和标记基因。(4)农杆菌转化法利用的是农杆菌的转化作用，将目的基因整合到受体细胞的染色体 DNA 上，进而使目的基因能够稳定遗传和表达。命题点二 基因工程的原理和应用3.下列关于基因工程应用的叙述，正确的是( )A.基因治疗就是把缺陷基因诱变成正常基因B.基因诊断的基本原理是 DNA 分子杂交C.一种基因探针能检测水体中的各种病毒D.利用基因工程生产乙肝疫苗时，目的基因存在于人体 B 淋
23、巴细胞的 DNA 中答案 B解析 基因治疗就是向目标细胞中引入正常功能的基因，以纠正或补偿基因的缺陷，达到治疗疾病的目的，A 错误；基因诊断又称 DNA 诊断或分子诊断，通过分子生物学和分子遗传学的技术，直接检测出分子结构水平和表达水平是否异常，从而对疾病做出判断，利用的原理就是 DNA 分子杂交，B 正确；基因探针是用放射性同位素(或荧光分子)标记的含有目的基因的 DNA 片段，一种基因探针只能检测水体中的一种或一类病毒，C 错误；基因工程生产乙肝疫苗是通过构建含有乙肝病毒表面抗原基因的重组质粒，然后转染(就是让质粒进入宿主细胞)相应的宿主细胞，如酵母菌、CHO 细胞(中国仓鼠卵巢细胞，一种
24、可以无限繁殖的细胞)，生产乙肝表面抗原蛋白，D 错误。4.科学家将鱼抗冻蛋白基因转入番茄，使番茄的耐寒能力大大提高，可以在相对寒冷的环境中生长。质粒上有 Pst、 Sma、 Hind、 Alu等四种限制性核酸内切酶切割位点，下图是转基因抗冻番茄培育过程的示意图( ampr为抗氨苄青霉素基因)，其中是转基因抗冻番茄培育过程中的相关步骤，、表示相关结构或细胞。请据图作答：(1)在构建重组 DNA 时，可用一种或多种限制性核酸内切酶进行切割，为了避免目的基因和载体在酶切后产生的末端发生任意连接，在此实验中应该选用限制性核酸内切酶_分别对_、_进行切割，切割后产生的 DNA 片段分别为_、_种。(2)
25、培养基中的氨苄青霉素会抑制番茄愈伤组织细胞的生长，要利用该培养基筛选已导入鱼的抗冻蛋白基因的番茄细胞，应使重组 DNA 中含有_作为标记基因。11(3)研究人员通常采用_法将鱼抗冻蛋白基因导入番茄细胞内。答案 (1) Pst、 Sma 含鱼抗冻蛋白基因的 DNA 质粒 4 2(2)抗氨苄青霉素基因(3)农杆菌转化解析 (1)在形成重组 DNA 分子中，如果目的基因和载体用同一种限制性核酸内切酶切割，获得的粘性末端相同，将会发生自身环化现象，故应选用不同的限制性核酸内切酶分别对目的基因和载体切割，以获得不同的粘性末端，故应选用 Pst和 Sma对含鱼抗冻蛋白基因的 DNA 和质粒进行切割， Ps
26、t和 Sma在鱼抗冻蛋白基因的 DNA 上共有 3 个酶切位点，切割后产生 4 个 DNA 片段，而环状质粒上有两个酶切位点，切割后产生 2 个 DNA 片段。(2)能在含氨苄青霉素的培养基中生长的细胞具有抗氨苄青霉素基因，故重组 DNA 分子中应含有抗氨苄青霉素基因作为标记基因。(3)将目的基因导入植物细胞的方法是农杆菌转化法。基因诊断与基因治疗(1)基因诊断方法：DNA 分子杂交法(即 DNA 探针法)，该方法是根据碱基互补配对原则，把互补的双链DNA 解开，把单链的 DNA 小片段用同位素、荧光分子或化学发光催化剂等进行标记，之后同被检测的 DNA 中的同源互补序列杂交，从而检出所要查明
27、的 DNA 或基因。步骤：抽取病人的组织或体液作为化验样品；将样品中的 DNA 分离出来，用化学法或热处理法使样品 DNA 解旋，将事先制作好的 DNA 探针引入化验样品中，这些已知的经过标记的探针能够在化验样品中找到互补链，并与之结合(杂交)在一起，找不到互补链的 DNA 探针，则可以被洗脱。这样通过对遗留在样品中的标记过的 DNA 探针进行基因分析，就能检出病人所得的病。(2)基因治疗原理：利用正常基因纠正或补偿基因的缺陷，即把正常基因导入患者体内，使该基因的表达产物发挥功能，从而达到治疗疾病的目的，而原有缺陷基因一般不作处理。方法：有体外基因治疗和体内基因治疗，体外基因治疗方法疗效好。如
28、重度免疫缺陷症的体外基因治疗方法：体内基因治疗：用基因工程的方法，直接向人体组织细胞中转移基因。12命题点三 设计用基因工程技术解决的方案5.人组织纤溶酶原激活物( htPA)是一种重要的药用蛋白，可在转 htPA 基因母羊的羊乳中获得。流程如下：(1)为获取更多的卵(母)细胞，要对供体母羊注射_，使其超数排卵。采集的精子需要经过_，才具备受精能力。(2)在 htPA 基因与质粒构建重组 DNA 分子的过程中，下列哪项是必需的( )A.限制性核酸内切酶和 DNA 连接酶B.DNA 连接酶和 DNA 聚合酶C.DNA 聚合酶和逆转录酶D.限制性核酸内切酶和 DNA 聚合酶(3)转基因羊的培育过程
29、中，常用受精卵作为外源基因的受体细胞，主要原因是_。为了获得母羊，胚胎移植前需对已成功转入目的基因的胚胎进行_。利用胚胎分割和胚胎移植技术可获得多个转基因个体，这些个体的基因型_。(4)若在转 htPA 基因母羊的羊乳中检测到_，说明目的基因成功表达。答案 (1)促性腺激素 获能处理 (2)A (3)受精卵的全能性易于表达 性别鉴定 相同 (4)htPA(或人组织纤溶酶原激活物)解析 (1)为获取更多的卵(母)细胞，要对供体母羊注射促性腺激素，使其超数排卵。采集的精子需要经过获能处理，才具备受精能力。(2)在 htPA 基因与质粒构建重组 DNA 分子的过程中，需要用到的工具酶为限制性核酸内切
30、酶和 DNA 连接酶。(3)转基因羊的培育过程中，常用受精卵作为外源基因的受体细胞，主要原因是受精卵的全能性易于表达。为了获得母羊，胚胎移植前需对已成功转入目的基因的胚胎进行性别鉴定。利用胚胎分割和胚胎移植技术可获得多个转基因个体，这些个体的基因型相同。(4)若在转 htPA 基因母羊的羊乳中检测到htPA(或人组织纤溶酶原激活物)，说明目的基因成功表达。探究真题 预测考向1.(2018浙江 4 月选考)回答与基因工程和植物克隆有关的问题：(1)将含某抗虫基因的载体和含卡那霉素抗性基因的载体 pBI121 均用限制性核酸内切酶EcoR酶切，在切口处形成_。选取含抗虫基因的 DNA 片段与切割后
31、的 pBI12113用 DNA 连接酶连接，在两个片段相邻处形成_，获得重组质粒。(2)已知用 CaCl2处理细菌，会改变其某些生理状态。取 CaCl2处理过的农杆菌与重组质粒在离心管内进行混合等操作，使重组质粒进入农杆菌，完成_实验。在离心管中加入液体培养基，置于摇床慢速培养一段时间，其目的是_，从而表达卡那霉素抗性基因，并大量增殖。(3)取田间不同品种水稻的幼胚，先进行_，然后接种到培养基中培养，幼胚发生_形成愈伤组织，并进行继代培养。用含重组质粒的农杆菌侵染愈伤组织，再培养愈伤组织，以便获得抗虫的转基因水稻。影响愈伤组织能否成功再生出植株的因素有：培养条件如光温、培养基配方如植物激素配比
32、、以及_(答出 2 点即可)。答案 (1)粘性末端 磷酸二酯键(2)转化 使 CaCl2处理过的农杆菌恢复细胞的正常状态(3)消毒 脱分化 水稻的基因型、愈伤组织继代的次数解析 (1)形成重组 DNA 时限制性核酸内切酶酶切得到的是粘性末端，DNA 连接酶连接两个DNA 片段之间形成的是磷酸二酯键。(2)目的基因导入植物细胞常用农杆菌转化法。Ca 2 处理方法可增加细菌细胞壁的通透性，让其处于感受态，以利于重组质粒导入。故细胞要正常表达相关基因，应让其恢复为正常状态。(3)不同种类植物或同种植物的不同基因型个体之间存在遗传的差异，细胞全能性的表达程度大小不同，小麦水稻等作物在多次继代培养后，会
33、丧失细胞全能性的表达能力。2.(2016浙江 4 月选考)兔肝细胞中的基因 E 编码代谢甲醛的酶，拟利用基因工程技术将基因 E 转入矮牵牛中，以提高矮牵牛对甲醛的代谢能力。请回答下列问题：(1)从兔肝细胞中提取 mRNA，在_酶的作用下形成互补的 DNA，然后以此 DNA 为模板扩增得到基因 E。在相关酶的作用下，将基因 E 与 Ti 质粒连接在一起，形成_，再导入用氯化钙处理的_中，侵染矮牵牛叶片。将被侵染的叶片除菌后进行培养，最终得到转基因矮牵牛。其中培养过程正确的是_。A.叶片在含适宜浓度生长素的培养基上分化形成愈伤组织B.愈伤组织在含细胞分裂素和生长素配比较高的培养基上形成芽C.再生的
34、芽在细胞分裂素含量高的培养基上生根D.愈伤组织在含适宜浓度植物生长调节剂的培养基上脱分化形成再生植株(2)取转基因矮牵牛叶片，放入含 MS 液体培养基和适量浓度甲醛且密封的试管中。将试管置于_上，进行液体悬浮培养。一段时间后测定培养基中甲醛的含量，以判断基因 E 是否在转基因矮牵牛中正常表达。培养过程中液体培养的作用：一是提供营养；二是_，从而使叶片保持正常的形态。答案 (1)逆转录 重组 DNA 分子 农杆菌 B14(2)摇床 维持渗透压解析 (1)以 mRNA 为模板合成 DNA 的过程为逆转录过程，这一过程需要在逆转录酶的作用下进行。获得目的基因后，需在限制性核酸内切酶和 DNA 连接酶
35、的作用下，将目的基因与载体(Ti 质粒)连接形成重组质粒(重组 DNA 分子)，再将其导入受体细胞。将目的基因导入植物细胞常用农杆菌转化法，先将重组 DNA 分子导入经氯化钙处理的农杆菌中，再用导入目的基因的农杆菌感染植物细胞，最终实现将目的基因导入植物细胞内的目的。导入目的基因的植物细胞经组织培养过程形成转基因植株。组织培养过程中，叶片在含适宜浓度的生长素和细胞分裂素的培养基上脱分化形成愈伤组织，然后在含细胞分裂素和生长素配比较高的培养基上形成芽，继而在生长素含量高的培养基上生根，最后形成完整的植株，愈伤组织形成植株的过程中发生细胞的分化。(2)植物组织培养过程中，将愈伤组织等细胞置于摇床上
36、，进行液体悬浮培养，形成多个分散的细胞。培养过程中培养液一方面为植物细胞提供营养，另一面维持一定的渗透压，从而使叶片保持正常的形态。3.(2015四川，9)将苏云金杆菌 Bt 蛋白的基因导入棉花细胞中，可获得抗棉铃虫的转基因棉，其过程如下图所示：注：农杆菌中 Ti 质粒上只有 TDNA 片段能转移到植物细胞中。请回答下列问题：(1)过程需用同种_酶对含 Bt 基因的 DNA 和 Ti 质粒进行酶切。为将过程获得的含重组质粒的农杆菌筛选出来，应使用_培养基。(2)过程中将棉花细胞与农杆菌混合后共同培养，旨在让_进入棉花细胞；除尽农杆菌后，还须转接到含卡那霉素的培养基上继续培养，目的是_。(3)若
37、过程仅获得大量的根，则应在培养基中增加_以获得芽；部分接种在无激素培养基上的芽也能长根，原因是_。(4)检验转基因棉的抗虫性状，常用方法是_。种植转基因抗虫棉能减少_的使用，以减轻环境污染。答案 (1)限制性核酸内切 选择(2)TDNA 筛选出获得 TDNA 片段的植物细胞(3)细胞分裂素浓度 芽顶端合成的生长素向基部运输，促进根的分化(4)投放棉铃虫 农药解析 (1)构建重组 DNA 分子的过程需要用同一种限制性核酸内切酶切割目的基因和质粒，15以便产生相同的粘性末端。只允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基叫做选择培养基，这里只允许含重组质粒的农杆菌生长，应使用
38、选择培养基。(2)过程中将棉花细胞与农杆菌混合后共同培养，旨在让重组质粒中的 TDNA 片段进入棉花细胞，除尽农杆菌后，还须转接到含卡那霉素的培养基上继续培养，目的是筛选出含目的基因的受体细胞。(3)生长素可诱导根的形成，细胞分裂素可诱导芽的形成。在没有激素的培养基上的芽也长出了根，可能与芽自身合成生长素并向下运输促进根的形成有关。(4)检验转基因棉的抗虫性状，常用方法是直接投放害虫，观察其生存情况。种植转基因抗虫棉能减少农药的使用，以减轻环境污染。课时作业一、选择题1.(2018台州模拟)下列关于基因工程的叙述，错误的是( )A.目的基因和受体细胞均可来自动物、植物或微生物B.限制性核酸内切
39、酶和 DNA 连接酶是两类常用的工具酶C.人胰岛素原基因在大肠杆菌中表达的胰岛素无生物活性D.载体上的抗性基因有利于筛选含重组 DNA 的细胞和促进目的基因的表达答案 D解析 目的基因来源于含有人们所需要性状的一切生物，可以是动物、植物，也可以是真菌、细菌等，A 正确；基因工程中一般要使用同种限制性核酸内切酶进行切割，以获得具有相同粘性末端的目的基因和载体，在 DNA 连接酶的作用下，将目的基因和载体连接起来，形成重组 DNA 分子，B 正确；人的胰岛素原基因可以在大肠杆菌内表达，但是由于大肠杆菌是原核生物，没有内质网、高尔基体等细胞器，合成的胰岛素不具有胰岛素的功能，即没有生物活性，C 正确
40、；标记基因是为了检测并筛选含重组 DNA 的细胞，但对于目的基因的表达没有影响，D 错误。2.(2019宁波模拟)基因编辑是指将外源 DNA 片段导入到细胞染色体特定位点或删除基因内部的片段，定点改造基因，获得预期的生物体基因序列发生遗传改变的技术。如图是对某生物 B 基因进行编辑的过程，该过程中用 sgRNA 可指引核酸内切酶 Cas9 结合到特定的切割位点，下列叙述正确的是( )A.sgRNA 是合成 Cas9 酶的模板B.sgRNA 的碱基序列与靶基因碱基序列能够全部互补16C.核酸内切酶 Cas9 可在特定切割位点断裂核苷酸之间的磷酸二酯键D.B 基因被编辑后因不能转录而无法表达相关蛋
41、白质答案 C解析 由题意知，sgRNA 可指引核酸内切酶 Cas9 结合到特定的切割位点，A 错误；由图可知，靶基因部分序列与 sgRNA 通过碱基互补配对原则进行配对，B 错误；核酸内切酶 Cas9 可断裂脱氧核糖核苷酸之间的化学键磷酸二酯键，C 正确；被编辑后的 B 基因仍能进行转录，D 错误。3.(2018浙江模拟)科学家利用生物技术将人的生长激素基因导入小鼠受精卵的细胞核中，经培育获得一种转基因小鼠，其膀胱上皮细胞可以合成人的生长激素并分泌到尿液中，在医学研究及相关疾病治疗方面都具有重要意义。下列有关叙述错误的是( )A.选择受精卵作为外源基因的受体细胞是因为这种细胞具有全能性B.采用
42、 DNA 分子杂交技术可检测外源基因在小鼠细胞内是否成功表达C.人的生长激素基因能在小鼠细胞内表达，说明遗传密码在不同种生物中可以通用D.将转基因小鼠体细胞进行核移植(克隆)，可以获得多个具有外源基因的后代答案 B解析 选择受精卵作为外源基因的受体细胞是因为这种细胞具有全能性，而且全能性最高，A 正确；采用 DNA 分子杂交技术可检测转基因生物的 DNA 上是否插入了目的基因，但不能检测外源基因在小鼠细胞内是否成功表达，B 错误；人的生长激素基因能在小鼠细胞内表达，说明遗传密码在不同种生物中可以通用，C 正确；将转基因小鼠体细胞进行核移植(克隆)，可以获得多个具有外源基因的后代，D 正确。4.
43、北极比目鱼中有抗冻基因，其编码的抗冻蛋白具有 11 个氨基酸的重复序列，该序列重复次数 越 多 ， 抗 冻 能 力 越 强 。 如 图 是 获 取 转 基 因 抗 冻 番 茄 植 株 的 过 程 示 意 图 ， 有 关 叙 述 正 确的 是 ( )A.过程获取的目的基因，可用于基因工程和比目鱼基因组测序B.将多个抗冻基因编码区依次相连成能表达的新基因，不能得到抗冻性增强的抗冻蛋白C.过程构成的重组质粒缺乏标记基因，需要转入农杆菌才能进行筛选D.应用 DNA 探针技术，可以检测转基因抗冻番茄植株中目的基因的存在及其是否完全表达答案 B解析 将多个抗冻基因编码区相连形成能表达的新基因，合成的蛋白质
44、为新的蛋白质，不能得到抗冻性增强的抗冻蛋白，B 正确；过程是利用逆转录法合成目的基因，由于没有非编码区和编码区中的内含子，所以不能用于比目鱼基因组测序；用作载体的质粒，必须具有标17记基因才能便于检测和筛选；应用 DNA 探针技术，可检测转基因抗冻番茄植株中目的基因的存在和转录，但不能检测目的基因是否成功表达，A、C、D 错误。二、非选择题5.(2018嘉兴模拟)我国目前临床使用的乙肝疫苗大多为基因工程疫苗，其有效成分是一种叫做乙肝表面抗原的蛋白质(S 蛋白)，对应的基因为 s 基因。请回答：(1)在构建重组 DNA 分子时，要用限制性核酸内切酶处理_，并用_酶使两者结合。将重组 DNA 分子
45、导入到哺乳动物细胞，经筛选得到工程细胞。(2)在细胞培养过程中，工程细胞在生长过程中有_现象，需要定期使用_酶处理，以便于分瓶培养。(3)为提高工程细胞培养的成功率，下列措施中不需采用的是_。A.取单个细胞进行培养 B.加入胰岛素C.二氧化碳培养箱 D.加入动物血清(4)由于哺乳动物细胞培养较难，成本较高，近些年科学家们又发明了“乳腺生物发生器” ，进而从转基因动物的乳汁中提取所需产品。在这种技术中，作为重组 DNA 分子受体细胞的一般是_。答案 (1)s 基因和载体 DNA DNA 连接 (2)接触抑制 胰蛋白 (3)A (4)受精卵解析 (1)在构建重组 DNA 分子时，要用限制性核酸内切
46、酶处理 s 基因和载体 DNA，并用 DNA连接酶使两者结合。(2)在动物细胞培养过程中存在接触抑制现象，需要定期使用胰蛋白酶处理，以便于分瓶培养。(3)取单个细胞进行培养不会提高工程细胞培养的成功率，A 错误；胰岛素能促进血糖进入组织细胞，因此提高工程细胞培养的成功率，应该在培养基中添加胰岛素，B 正确；动物细胞培养时需要一定的气体环境，因此需要放在二氧化碳培养箱中，CO2的主要作用是维持培养液的 pH，C 正确；动物细胞培养时，为了给细胞提供充足的营养，需要在培养基中加入动物血清，D 正确。(4)培育转基因动物时，应该以受精卵作为受体细胞，因为受精卵的全能性最高。6.(2018绍兴联考)基因敲除是针对某个序列已知但功能未知的基因，改变其基因结构，令该基因功能丧失，从而对生物体造成影响，进而推测出该基因功能的一门技术。以下是制备APOE 基因敲除小鼠的常规过程：注： Neo 基因是抗新霉素的抗药基因；APOE 是载脂蛋白 E，参与脂蛋白的代谢与转化。请回答：18(1)为了获得 APOE 基因，可以用_或者 PCR 扩增。过程中所需的工具酶有_。 Neo 基因除了破坏 APOE 基因外，还具有的作用最可能是_。(2)培养小鼠胚胎干细胞时，首先要在培养皿底部制备饲养层，用于饲养层的细胞一般是_。
