1、VEREIN DEUTSCHERINGENIEUREMonitoring der Wirkungen gentechnischvernderter Organismen (GVO) PCR-Verfahren zum Nachweisgentechnisch vernderter Nukleinsurenin der UmweltMonitoring of effects of genetically modified organisms (GMOs)PCR-methods for the detection of genetically modified nucleic acids in t
2、he environment VDI 4330Blatt 7 / Part 7 Ausg. deutsch/englischIssue German/EnglishKompetenzfeld Biotechnologie Fachbeirat Monitoring der Wirkungen von gentechnisch vernderten OrganismenAusschuss Molekularbiologische Diagnostik VDI-Handbuch Biotechnologie, Band 1: GVO-Monitoring VDI-Handbuch Landwirt
3、schaft/Landtechnik VDI-RICHTLINIENZu beziehen durch / Available from Beuth Verlag GmbH, 10772 Berlin Alle Rechte vorbehalten / All rights reserved Verein Deutscher Ingenieure e.V., Dsseldorf 2006Vervielfltigung auchfr innerbetriebliche Zwecke nicht gestattet / Reproduction even for internal use not
4、permittedDie deutsche Version dieser Richtlinie ist verbindlich. ICS 07.080 Dezember 2006December 2006Inhalt SeiteEinleitung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21 Anwendungsbereich . . . . . . . . . . . . . 22 Normative Verweise . . . . . . . . . . . . . 23Begrife . . . . . . . . . . . . . .
5、. . . . . . 34 Kurzbeschreibung des Verfahrens . . . . . 45 Reagenzien . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46 Labororganisation . . . . . . . . . . . . . . 57 Durchfhrung des PCR-Verfahrens . . . . . 57.1 Verwendung von DNA-Extrakten . . . . 57.2 Methodenanforderungen und -bedingungen . . . . . . .
6、. . . . . . . . 58Auswertung. . . . . . . . . . . . . . . . . . 69 Untersuchungsbericht . . . . . . . . . . . . 610 Leistungsverhalten und Qualittssicherung 6Schrifttum . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7Anhang A Profile der einzelnen PCR-Verfahren . . . . . . . . . . . . . . . 7A1 Verfahren
7、 fr die 35S/pat-Genkassette. . . . . . . . . . . . 7A2 Verfahren fr die pSSUAra/bar-Genkassette. . . . . . . . . . . . 10A3 Verfahren fr die p35S/nptII-Genkassette. . . . . . . . . . . . 14A4 Screening-Verfahren nach DIN EN ISO 21569 und DINENISO21570 . . . . . . . 18A5 Spezifische Verfahren nach DI
8、N EN ISO 21569 und DINENISO21570 . . . . . . . 19A6 Im Zuge der Zulassung von GVO nach VO (EG) Nr. 1829/2003 validierte Real-Time-PCR-Ver-fahren. . . . . . . . . . . . . . . 20Contents PageIntroduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21 Scope of application . . . . . . . . . . . . . 22 Norma
9、tive references. . . . . . . . . . . . . 23 Definition of terms . . . . . . . . . . . . . . 34 Brief description of the procedure . . . . . . 45Reagents . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46 Laboratory organization . . . . . . . . . . . 57 PCR protocol . . . . . . . . . . . . . . . . . 57.1 Use o
10、f DNA extracts . . . . . . . . . . . .57.2 Method requirements and conditions . . . . . . . . . . . . . . . . . 58 Evaluation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 69 Test report. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 610 Performance and quality assurance . . . . . 6Bibliography . . . . . . . . . . .
11、. . . . . . . . . 7Annex A Characteristics of various PCR methods . . . . . . . . . . . . . . . . 7A1 PCR method specific for the35S/pat gene cassette . . . . . . . .8A2 PCR method specific for thepSSUAra/bar gene cassette . . . . 10A3 PCR method specific for thep35S/nptII gene cassette . . . . . 14
12、A4 Screening procedures accordingto DIN EN ISO 21569 and DIN EN ISO 21570. . . . . . . . 18A5 Specific procedures accordingto DIN EN ISO 21569 and DIN EN ISO 21570. . . . . . . . 19A6 Real-time PCR procedures that have been validated in the courseof the authorisation of GMOsaccording to regulation (
13、EC) No. 1829/2003 . . . . . . . . . . 20Frhere Ausgabe: 09.05 EntwurfFormer edition: 09/05 DraftThe German version of this guideline shall be taken as authorita-tive. No guarantee can be given with respect to the English trans-lation.B55EB1B3E14C22109E918E8EA43EDB30F09DCCB7EF86D9NormCD - Stand 2012-
14、08All rights reserved Verein Deutscher Ingenieure e.V., Dsseldorf 2006 2 VDI 4330 Blatt 7 / Part 7EinleitungIn der EU-Richtlinie 2001/18/EG ist geregelt, dassgentechnisch vernderte Organismen, die in den Ver-kehr gebracht werden, nach Magabe der Genehmi-gung zu beobachten sind, um mgliche schdlicheA
15、uswirkungen auf die zu Grunde gelegten Rechtsg-ter zu ermitteln. Fr die Durchfhrung der Beobach-tungsprogramme kann es erforderlich sein, GVOnachzuweisen. Eine Vergleichbarkeit der Erhebun-gen kann jedoch nur dann gewhrleistet werden,wenn hierbei erprobte und standardisierte Prfver-fahren Einsatz fi
16、nden. Im Rahmen der Richtliniense-rie VDI 4330 werden daher methodenspezifischeRichtlinienbltter fr den nukleinsurebasiertenNachweis von gentechnischen Vernderungen ver-ffentlicht. 1 AnwendungsbereichDie vorliegende Richtlinie beschreibt Verfahren zumNachweis gentechnisch vernderter Organismen(GVO)
17、mit der Polymerasekettenreaktion (PCR). Diehier beschriebenen Einzelverfahren sind geeignet,Genkonstrukte, die hufig in GVO vorkommen,nachzuweisen (Screening“). Darber hinaus findensich Verweise auf weitere konstrukt- und ereignisspe-zifische Verfahren in den Anhngen. Geeignete Verfahren zur Entnahm
18、e, dem Transportund der Lagerung von Proben und zur Extraktion vonNukleinsuren werden in den Richtlinien VDI 4330Blatt 5 und Blatt 6 beschrieben werden.Das in dieser Richtlinie beschriebene Verfahren eig-net sich u.a. zur Untersuchung von DNA aus Pflan-zenmaterialien, Bden und Komposten. Die Richtli
19、niekann aber auch zur Untersuchung von DNA weitererMatrices wie Futter- und Lebensmittel angewendetwerden. Detaillierte Angaben zu einzelnen spezifischen Ver-fahren sind in den Anhngen dargestellt.2 Normative VerweiseDiese Richtlinie enthlt Verweise auf nachstehendaufgefhrte technische Regeln:DIN EN
20、 ISO 21569 : 2005-09 Lebensmittel; Verfah-ren zum Nachweis von gentechnisch modifiziertenOrganismen und ihren Produkten; Qualitative aufNukleinsuren basierende Verfahren (ISO 21569:2005); Deutsche Fassung EN ISO 21569:2005.Berlin: Beuth VerlagDIN EN ISO 21570 : 2006-02 Lebensmittel; Verfah-ren zum N
21、achweis von gentechnisch modifiziertenOrganismen und ihren Produkten; Quantitative aufIntroductionThe EU guideline 2001/18/EC determines that genet-ically modified organisms that are placed on the mar-ket must be monitored as specified in the approval inorder to detect possible harmful effects on th
22、e under-lying assets. For the realisation of the monitoring pro-grammes, it might be required to detect GMOs. How-ever, the comparability of the surveys can only beguaranteed if field-tested and standardised test meth-ods are used. Therefore, method-specific guidelinesfor the nucleic acid-based dete
23、ction of genetic modi-fications are published within the framework of theguideline series VDI 4330.1 Scope of applicationThis guideline describes procedures for the detectionof genetically modified organisms (GMOs) using thepolymerase chain reaction (PCR). The described in-dividual procedures are su
24、itable for detecting geneconstructs that exist frequently in GMOs (“scree-ning”). Furthermore, references to other construct-specific or event-specific procedures can be found inthe annexes.Suitable methods for collection, transport, and sto-rage of samples as well as for the extraction of nuc-leic
25、acids will be given in guidelines VDI 4330 Part 5and Part 6.The procedure described in this guideline is suited,amongst other samples, for the analysis of DNA ex-tracted from plant materials, soil, and compost. Thismethod can also be applied to analyse DNA fromother matrices, such as feed materials
26、and foodstuffs.Detailed information regarding specific procedures isgiven in the appendices. 2 Normative referencesThis guideline contains references to the followingtechnical rules:DIN EN ISO 21569 : 2005-09 Foodstuffs; Methodsof analysis for the detection of genetically modifiedorganisms and deriv
27、ed products; Qualitative nu-cleic acid based methods (ISO 21569:2005); Ger-man version EN ISO 21569:2005. Berlin: BeuthVerlagDIN EN ISO 21570 : 2006-02 Foodstuffs; Methodsof analysis for the detection of genetically modifiedorganisms and derived products; Quantitative nu-B55EB1B3E14C22109E918E8EA43E
28、DB30F09DCCB7EF86D9NormCD - Stand 2012-08Alle Rechte vorbehalten Verein Deutscher Ingenieure e.V., Dsseldorf 2006 VDI 4330 Blatt 7 / Part 7 3 Nukleinsuren basierende Verfahren (ISO 21570:2005); Deutsche Fassung EN ISO 21570:2005.Berlin: Beuth VerlagDIN EN ISO 21571 : 2005-05 Lebensmittel; Verfah-ren
29、zum Nachweis von gentechnisch modifiziertenOrganismen und ihren Produkten; Nukleinsureex-traktion (ISO 21571:2005); Deutsche Fassung ENISO 21571:2005. Berlin: Beuth VerlagDIN EN ISO 24276 : 2006-05 Lebensmittel; Verfah-ren zum Nachweis von gentechnisch modifiziertenOrganismen und ihren Produkten; Al
30、lgemeine An-forderungen und Definitionen (ISO 24276:2006);Deutsche Fassung EN ISO 24276:2006. Berlin:Beuth VerlagVDI 4330 Blatt 5 Monitoring der Wirkungen gen-technisch vernderter Organismen; Probenahmevon Pflanzenmaterial fr den Nachweis gentech-nisch modifizierter Nukleinsuren in der Umwelt(in Vor
31、bereitung)VDI 4330 Blatt 6 Monitoring der Wirkungen gen-technisch vernderter Organismen (GVO); DNA-Extraktion (in Vorbereitung)Methoden des CRL (Gemeinschaftliches Referenzla-boratorium der EU, siehe Anhang A6)3BegriffeBegriffe werden in Anlehnung an die DIN ENISO 24276 verwendet.Amplifikationsreage
32、nzkontrolleKontrolle, die auer der extrahierten Matrizen-DNAder Untersuchungsprobe smtliche Reagenzien ent-hlt. Anstelle der Matrizen-DNA wird ein entsprechen-des Volumen nukleinsurefreies Wasser zur Reaktionhinzugefgt.NachweisgrenzeDie Nachweisgrenze ist bei qualitativen Verfahrendie niedrigste Kon
33、zentration oder der geringste Ge-halt der Zielsequenz, die/der zuverlssig nachgewie-sen, jedoch nicht unbedingt quantifiziert werdenkann, wie durch einen Ringversuch oder Validierungeines einzigen Labors gezeigt wurde.Negative ExtraktionskontrolleEine Kontrolle, bei der smtliche Extraktionsschritteo
34、hne Zugabe der Untersuchungsprobe durchgefhrtwerden.Positive DNA-ZielkontrolleReferenz-DNA oder DNA, die aus einem zertifizier-ten Referenzmaterial oder einer bekannten Positiv-probe, die fr die zu untersuchende Sequenz oder dencleic acid based methods (ISO 21570:2005); Ger-man version EN ISO 21570:
35、2005. Berlin: BeuthVerlagDIN EN ISO 21571 : 2005-05 Foodstuffs; Methodsof analysis for the detection of genetically modifiedorganisms and derived products; Nucleic acid ex-traction (ISO 21571:2005); German version ENISO 21571:2005. Berlin: Beuth VerlagDIN EN ISO 24276 : 2006-05 Foodstuffs; Methodsof
36、 analysis for the detection of genetically modifiedorganisms and derived products; General require-ments and definitions (ISO 24276:2006); Germanversion EN ISO 24276:2006. Berlin: Beuth VerlagVDI 4330 Part 5 Monitoring of effects of geneticallymodified organisms (GMO); Sampling of plant ma-terial fo
37、r the detection of genetically engineerednucleic acids in the environment (in preparation)VDI 4330 Part 6 Monitoring of effects of geneticallymodified organisms (GMO); DNA extraction (inpreparation)CRL methods (Community Reference Laboratory ofthe EU, see Annex A6)3 Definition of termsThe following
38、technical terms are used according toDIN EN ISO 24276.Amplification reagent controlControl, containing all the reagents, except the ex-tracted test sample template DNA. Instead of the tem-plate DNA, a corresponding volume of nucleic acidfree water is added to the reaction. Limit of detection (LOD)Li
39、mit of detection for qualitative methods is the low-est concentration or content of the target sequencethat can be detected, but not necessarily be quantifiedreliably, as demonstrated by satisfactory collabora-tive trial or single-laboratory validation. Negative extraction controlA control in which
40、all extraction steps are carried outwithout adding the test sample.Positive DNA target controlReference DNA or DNA extracted from a certifiedreference material or known positive sample repre-sentative of the sequence or organism under study.B55EB1B3E14C22109E918E8EA43EDB30F09DCCB7EF86D9NormCD - Stan
41、d 2012-08All rights reserved Verein Deutscher Ingenieure e.V., Dsseldorf 2006 4 VDI 4330 Blatt 7 / Part 7zu untersuchenden Organismus reprsentativ ist, ex-trahiert wurde. Die Kontrolle ist dafr vorgesehen, zuzeigen, wie das Analysenergebnis von Untersuchungs-proben aussieht, die die Zielsequenz enth
42、alten. PCR-InhibitionskontrolleReaktionsansatz, der die Mglichkeit bietet, einePCR-Inhibition in einem auf einen Zielanalyten aus-gerichteten Nachweissystem in einer bestimmtenProbe zu erkennen.Untersuchungsprobe (Einwaage)Eine fr die Untersuchung oder Analyse vorbereiteteProbe; die gesamte Menge wi
43、rd gleichzeitig geprftoder analysiert.Zielsequenz DNA-Sequenz, die fr eine taxonomische Zielgruppeoder gemeinsame DNA-Sequenzen einer Gruppe vongentechnisch vernderten Organismen spezifisch istbzw. auf einem Genkonstrukt oder einem Transfor-mationsereignis basiert.4 Kurzbeschreibung des VerfahrensQu
44、alitative PCR-Verfahren basieren auf dem spezifi-schen Nachweis einer DNA-Zielsequenz in einer Un-tersuchungsprobe. Die Verfahren bestehen aus derAmplifikation der Zielsequenz, dem Nachweis desAmplifikats sowie einer Besttigung der Spezifittder amplifizierten DNA.Die Amplifikation der Zielsequenz er
45、folgt unter defi-nierten Reaktionsbedingungen. Die entstandenenAmplifikate knnen z.B. durch Gel-Elektrophoresenachgewiesen werden. Dabei wird die Lnge derAmplifikate unter Anwendung von entsprechendenLngenstandards berprft. Zur Identifizierung deramplifizierten Zielsequenz ist eine Restriktionsana-l
46、yse, eine DNA-Sequenzierung oder eine Hybridisie-rung mit einer fr die amplifizierte Zielsequenz spe-zifischen Sonde durchzufhren.5ReagenzienEs sind nur fr die Molekularbiologie geeignete Rea-genzien zu verwenden. Fr die PCR-Reaktion sindmindestens folgende Reagenzien erforderlich:Desoxyribonukleosi
47、d-Triphosphat-(dNTP-)Lsung,die dATP, dCTP, dGTP, dTTP/dUTP enthlt; PCR-Pufferlsungen (mit geeignetem Gehalt an MgCl2);DNA-freies Wasser; thermostabile DNA-Polymerase(bevorzugt hitzeaktivierbar); Forward-Primer, Re-verse-Primer; Proben-DNA; Kontroll-DNA.The control is intended to demonstrate the resu
48、lt ofanalyses of test samples containing the target se-quence.PCR inhibition controlReaction setup that allows detecting a PCR inhibitionin a certain sample according to a detection systemaimed at a target analyte.Test sample (test portion) A sample, as prepared for testing or analysis, thewhole qua
49、ntity being used for analysis or testing atone time.Target sequence DNA sequence that is specific for a taxonomic targetgroup or common DNA sequences of a group of ge-netically modified organisms (based on a gene con-struct or a transformation event). 4 Brief description of the procedureQualitative PCR methods are based on the specificdetection of a DNA target sequence in a test sample.The methods consist of amplifying the target se-quence, detecting the amplicon and confirm
