1、Frhere Ausgabe: 07.05 EntwurfFormer edition: 07/05 DraftVEREIN DEUTSCHERINGENIEUREMonitoring der Wirkungen gentechnisch vernderter Organismen (GVO)PollenmonitoringTechnische Pollensammlung mit Pollenmassenfilter (PMF) und Sigma-2-SammlerMonitoring the effects of genetically modified organisms (GMO)
2、Pollen monitoringTechnical pollen sampling using pollen mass filter (PMF) and Sigma-2-samplerVDI 4330Blatt 3 / Part 3Ausg. deutsch/englischIssue German/EnglishVDI-Handbuch Biotechnologie, Band 1: GVO-MonitoringVDI/DIN-Handbuch Reinhaltung der Luft, Band 1a: Maximale ImmissionswerteVDI-Handbuch Landw
3、irtschaft/LandtechnikVDI-RICHTLINIENZu beziehen durch / Available at Beuth Verlag GmbH, 10772 Berlin Alle Rechte vorbehalten / All rights reserved Verein Deutscher Ingenieure e.V., Dsseldorf 2007Vervielfltigung auchfr innerbetriebliche Zwecke nicht gestattet / Reproduction even for internal use not
4、permittedDie deutsche Version dieser Richtlinie ist verbindlich.ICS 07.080, 13.020.99Januar 2007January 2007Inhalt SeiteEinleitung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21 Anwendungsbereich . . . . . . . . . . . . . 32 Grundlage des Verfahrens . . . . . . . . . . 33 Probenahmeeinrichtung. . . . . .
5、. . . . . . 43.1 Gerte und Materialien . . . . . . . . . . 43.2 Technische Umsetzung . . . . . . . . . . 64 Probenahme . . . . . . . . . . . . . . . . . . 84.1 Standortbedingungen . . . . . . . . . . . 84.2 Aufstellen der Gerte . . . . . . . . . . . 94.3 Expositionsdauer . . . . . . . . . . . . . 94
6、.4 Probenahme im Gelnde . . . . . . . . . 104.5 Probenaufbereitung . . . . . . . . . . . . 115 Mikroskopische Pollenanalyse . . . . . . . . 145.1 Sigma-2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . 145.2 PMF . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 176 Molekularbiologische DNA-Analysen . . . . 207 Bestimmung d
7、er Zielgren fr dasGVO-Monitoring und Darstellung der Ergebnisse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 217.1 Sigma-2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . 217.2 PMF . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 238 Kennwerte der Verfahren . . . . . . . . . . . 258.1 Validierung . . . . . . . . . . . . . . . .
8、258.2 Messwerteverteilung. . . . . . . . . . . . 278.3 Methodischer Ansatz und Bestimmung grundlegender Parameter . . . . . . . . . 278.4 Sigma-2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . 308.5 PMF . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36Contents PageIntroduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21
9、 Scope of application . . . . . . . . . . . . . . 32 Basic principle of the procedure . . . . . . . . 33 Sampling equipment . . . . . . . . . . . . . . 43.1 Instruments and materials. . . . . . . . . . 43.2 Technical implementation. . . . . . . . . . 64Sampling. . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
10、 . 84.1 Site conditions . . . . . . . . . . . . . . . 84.2 Installing the equipment . . . . . . . . . . 94.3 Exposure time . . . . . . . . . . . . . . . . 94.4 Sampling at site . . . . . . . . . . . . . . .104.5 Sample preparation . . . . . . . . . . . . .115 Microscopic pollen analysis . . . . . .
11、. . . .145.1 Sigma-2 sampler . . . . . . . . . . . . . .145.2 PMF . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .176 Molecular-biological DNA analyses . . . . . .207 Determination of the target parameters for GMO monitoring and representation of the results . . . . . . . . . . . . . . . . . .217.1 Sigma-2 s
12、ampler . . . . . . . . . . . . . .217.2 PMF . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .238 Characteristic parameters of the methods . .258.1 Validation . . . . . . . . . . . . . . . . . .258.2 Distribution of measured values . . . . . .278.3 Methodical approach and determinationof basic parameters . . .
13、 . . . . . . . . . .278.4 Sigma-2 sampler . . . . . . . . . . . . . .308.5 PMF . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .36VDI-Kompetenzfeld BiotechnologieAusschuss Technische PollensammlungFachbeirat Monitoring der Wirkungen von genetisch vernderten Organismen (GVO)The German version of this guideline
14、 shall be taken as autho-ritative. No guarantee can be given with respect to the Englishtranslation.B55EB1B3E14C22109E918E8EA43EDB30F09DCCB7EF86D9NormCD - Stand 2012-08All rights reserved Verein Deutscher Ingenieure e.V., Dsseldorf 20072 VDI 4330 Blatt 3 / Part 3 Seite8.6 Parallelmessungen . . . . .
15、 . . . . . . . . 408.7 Vergleichsmessungen mit der Burkard-Falle. . . . . . . . . . . . . . . . 438.8 Pollenspektrum . . . . . . . . . . . . . . . 449 Qualittssicherung . . . . . . . . . . . . . . . 529.1 Allgemeine Messstrategie und Aufgaben-stellung des Pollenmonitoring mit technischen Sammlern .
16、. . . . . . . . . . 529.2 Standortprotokoll . . . . . . . . . . . . . . 529.3 Probenbegleitschein . . . . . . . . . . . . 529.4 Parallelmessungen . . . . . . . . . . . . . 529.5 Vergleichsmessungen mit Aktivgerten als Eichsttzpunkte. . . . . . . . . . . . . 539.6 Referenzmaterialien . . . . . . . .
17、. . . . 539.7 Qualifizierung . . . . . . . . . . . . . . . 53Schrifttum . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54EinleitungIn der Ausbreitung von gentechnisch verndertenOrganismen (GVO) kommt dem Pollenflug einebedeutsame Rolle zu. Fr ein Monitoring vonGVO wird daher ein Verfahren beschrieben, da
18、s dieErfassung und Dokumentation von Eintrag und Ver-breitung von GVO ber Pollen in einem bundesweitund naturraum-reprsentativ angelegten Messnetzermglicht. Bei diesem Verfahren werden technischeund biologische Pollensammler (VDI 4330 Blatt 4)sowie PCR-Screening-Verfahren zum Nachweis desGVO-Eintrag
19、es (VDI 4330 Blatt 5, Blatt 6, Blatt 7und Blatt 8) eingesetzt. In der vorliegenden Richtli-nie wird ein technisches Sammelsystem beschrieben.Die derzeit bekannten Pollenfallen sind hierzu nurbedingt geeignet, da sie entweder nicht standardisier-bar oder die Gerte fr Expositionszeitrume ausge-legt si
20、nd, die fr das GVO-Monitoring ungeeignetsind. Eine Einschrnkung bei den gebruchlichenPollensammlern ist auch die notwendige Stromver-sorgung, wie es z.B. bei der Burkard-Falle der Fallist. Solche Gerte sind damit rumlich nur begrenzteinsetzbar.Aus diesen Grnden wurde fr das GVO-Monitoringein Passivs
21、ammler entwickelt, der als Kombinations-gert, bestehend aus einem neuartigen Pollensamm-ler dem Pollenmassenfilter (PMF) und dem Depo-sitionssammler Sigma-2 nach VDI 2119 Blatt 4, ein-gesetzt wird. Die vorliegende Richtlinie ersetzt nichtVDI 2119 Blatt 4, sondern behandelt die fr dasGVO-Monitoring e
22、rforderlichen spezifischen Ergn-zungen.Page8.6 Parallel measurements . . . . . . . . . . . 408.7 Comparative measurements using the Burkard trap . . . . . . . . . . . . . . . . 438.8 Pollen diversity. . . . . . . . . . . . . . . 449 Quality assurance and quality control . . . . 529.1 General monitor
23、ing strategy and terms of reference of pollen monitoring with technical samplers . . . . . . . . . . . . . 529.2 Site protocol . . . . . . . . . . . . . . . . 529.3 Accompanying documentation for samples. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 529.4 Parallel measurements . . . . . . . . . . . 529.5 Com
24、parative measurements using active samplers as calibration bases . . . . . . . 539.6 Reference materials . . . . . . . . . . . . 539.7 Qualification . . . . . . . . . . . . . . . . 53Bibliography . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54IntroductionPollen dispersal plays a significant role in the d
25、issem-ination of genetically modified organisms (GMO).For a GMO monitoring a procedure is described thatenables quantification and documentation of GMOinput and spread through pollen in a nationwidemeasuring network that represents natural lands.Technical and biological pollen samplers (VDI 4330Part
26、 4) and PCR screening procedures are used forthe detection of GMO input (VDI 4330 Part 5, Part 6,Part 7 and Part 8). In this guideline a technical sam-pling system is described.Presently known pollen traps are only partially suitedfor this purpose, since they can neither be standard-ised nor is the
27、instrumentation designed for exposuretimes that are suitable for GMO monitoring. Anotherlimitation of commonly used pollen samplers is therequirement for a power supply, e.g. as for theBurkard trap. The use of these instruments is there-fore restricted to a limited exposure area.For these reasons, a
28、 new type of pollen sampler, thepollen mass filter (PMF), was developed. The PMF isused in combination as accessory device to theSigma-2 deposition sampler according to VDI 2119Part 4. This guideline deals with specific supplementsrequired for GMO monitoring; it does not replaceVDI 2119 Part 4.B55EB
29、1B3E14C22109E918E8EA43EDB30F09DCCB7EF86D9NormCD - Stand 2012-08Alle Rechte vorbehalten Verein Deutscher Ingenieure e.V., Dsseldorf 2007 VDI 4330 Blatt 3 / Part 3 31 AnwendungsbereichDiese Richtlinie beschreibt ein Verfahren, mit demPollen mit dem Depositionssammler Sigma-2 zusam-men mit dem PMF gesa
30、mmelt werden knnen. Anden Proben soll der Polleneintrag nach Art und An-zahl sowie der Anteil an transgenen Pollen bestimmtwerden. Der Sigma-2-Sammler dient hierbei derstandardisierten Probenahme zur direkten mikrosko-pischen Pollenanalyse. Mit dem PMF erhlt man aus-reichende Pollenmengen fr eine mo
31、lekularbiologi-sche Diagnostik.Notwendige Grundlagen zum Verstndnis dieserRichtlinie sind in VDI 4330 Blatt 1 und Blatt 2 dar-gelegt. Die Sammlung von Pollen mit technischenSammlern fr das GVO-Monitoring ist in unmittel-barem Zusammenhang mit der biologischen Honig-sammlung durch die Honigbiene zu s
32、ehen (VDI 4330Blatt 4).Der Einsatz der technischen Passivsammler und derbiologischen, aktiven Sammlerin Honigbiene ergn-zen sich in vielfltiger Weise fr das Pollenmonito-ring von GVO. Whrend die technischen SammlerErgebnisse zum Polleneintrag am Standort liefern,zeigen die Bienen eine raumbergreifen
33、de Samme-laktivitt, die einen Querschnitt ber die im Raumetablierten, blhenden Pflanzen ergibt. Mit beidenSammelverfahren wird ein breites Pollenartenspekt-rum erfasst, wobei sich die Verfahren ber die Vege-tationszeit ergnzen. Fr Rckschlsse auf eine Her-kunft von GVO sind gegebenenfalls weitere, hi
34、ernicht behandelte Verfahren und Informationen erfor-derlich.2 Grundlage des VerfahrensDer technische Pollensammler besteht aus zwei Ge-rten:Der Sigma-2 dient der Bestimmung der Pollendepo-sitionsrate. Die luftgetragenen Pollen gelangen durchdie seitlich versetzten Schlitze in den Innenraum desDepos
35、itionssammlers. Sie sedimentieren in demSammler auf der am Grund befindlichen Haftfolie.Die Abscheidung erfolgt wind- und niederschlagge-schtzt in dem turbulenzarmen Innenraum desSammlers.Die abgeschiedenen Pollen werden auf der Deposi-tionsflche lichtmikroskopisch direkt nach Art undAnzahl ausgewer
36、tet. Hierfr knnen auch bild-analytische Verfahren zur automatischen Erkennungeingesetzt werden. Die Regelexpositionsdauer nachVDI 2119 Blatt 4 betrgt eine Woche, fr den in die-ser Richtlinie beschriebenen besonderen Anwen-dungszweck wird eine zwei- bis vierwchige Expo-sitionsdauer empfohlen (Begrndu
37、ng siehe1 Scope of applicationThis guideline describes a procedure for the com-bined use of the deposition-type Sigma-2 samplerand the PMF to sample pollen. Collected samples areused to analyse pollen input with regard to speciesand amount, and percentage of transgenic pollen. TheSigma-2 sampler her
38、e provides a standardised sam-pling method for direct microscopic pollen analysis.Using the PMF yields sufficient amounts of pollen tocarry out molecular-biological diagnostics.The essential background in order to understand thisguideline is given in VDI 4330 Part 1 and Part 2. Pol-len sampling usin
39、g technical samplers for GMOmonitoring should be directly related to thebiological collection of honey by bees (VDI 4330Part 4).The application of technical passive samplers and theuse of honey bee colonies as active biological collec-tors complement each other in a manifold way formonitoring of GMO
40、 through pollen. Whereas techni-cal samplers provide results from the pollen input atthe sampling site, the wide-ranging collecting activ-ity of bees gives rise to a representative profile offluxering plants established in the area. By usingthese two sampling methods a broad range of pollenspecies i
41、s covered, as the methods complement eachother with regard to the vegetation period, too. Todraw conclusions on the origin of GMO further pro-cedures are required, which are not mentioned hereare nessesary.2 Basic principle of the procedureThe technical pollen sampler consists of two instru-ments:Th
42、e Sigma-2 sampler is designed for determining thepollen deposition rate. Wind-dispersed pollen grainsenter the interior through the laterally shifted slits ofthe deposition sampler. The pollen sediment on theadhesive foil at the bottom of the sampler. Thus, thedeposition takes place in the turbulenc
43、e-depleted in-terior of the sampler which provides protection fromwind and rain.Pollen adhering to the deposition area is directly ana-lysed with regard to species and amount by means oflight microscopy. For this purpose, image-analysismethods can be employed for automated identifica-tion. According
44、 to VDI 2119 Part 4 the regular expo-sure time is one week; for the particular applicationdescribed in this guideline a two- to four-week expo-sure time is recommended (the rationale for this isgiven in Section 4.3). The microscopic single-particleB55EB1B3E14C22109E918E8EA43EDB30F09DCCB7EF86D9NormCD
45、 - Stand 2012-08All rights reserved Verein Deutscher Ingenieure e.V., Dsseldorf 20074 VDI 4330 Blatt 3 / Part 3 Abschnitt 4.3). Fr den jeweiligen Zeitraum liefertdie mikroskopische Einzelpartikelanalyse eine mitt-lere Pollendepositionsrate. Der Pollenmassenfilter (PMF) ist auf eine ca. 10- bis100-fa
46、ch hhere Sammeleffizienz ausgelegt, sodassdie Pollenproben auch fr Untersuchungen auf einenmglichen Eintrag von GVO durch molekularbiologi-sche DNA-Analyseverfahren (z.B. PCR) eingesetztwerden knnen. Der PMF besteht aus einem ge-schichteten, innen hohlen Filterkrper, der so beschaf-fen ist, dass die
47、 Luft nahezu ungehindert hindurch-streichen kann. Pollen werden jedoch zurckgehalten.Die seitlich angebrachte Sammelflasche dient zumAuffangen von Regenwasser. Fr den PMF wird eineExpositionsdauer von vier Wochen empfohlen (Ab-schnitt 4.3), sodass mit wenigen Proben die relevantenBlhzeitrume abgedec
48、kt werden knnen. Zur Abdeckung des gesamten Blhzeitraums kanneine entsprechende Anzahl von vierwchigen Exposi-tionsphasen (Messperioden) aneinandergereiht wer-den.Die Kombination aus PMF und Sigma-2 ergab inFreilandtests eine gute Eignung fr das Umwelt-monitoring von GVO 1.3 Probenahmeeinrichtung3.1
49、 Gerte und MaterialienDie vollstndige Probenahmeeinrichtung mit Sigma-2-Sammler und PMF wird in Bild 1 dargestellt. Sieist kommerziell erhltlich.1)Sigma-2-SammlerAnstelle der in VDI 2119 Blatt 4 beschriebenenPVC-Folie wird als Haftmedium eine Acrylfolie oderdie Verwendung von Objekttrgern empfohlen, diemit einem witterungsbestndigen Kleber, z.B. demangegebenen Acrylesterpolymerisat, beschichtetetsind. Die vorbereitete Haftflche mit dem entspre-chenden Trger z
