1、AFNL NF T72-231 138 W LOI12372 OI15787L 853 ISSN 0335-3931 NF T 72-231 Aot 1988 Antiseptiques et dsinfectants utilises ltat liquide, miscibles leau Dtermination de lactivit sporicide Mthode par filtration sur membranes E : Water-miscible, antiseptics and disinfectants used in liquid form - Determina
2、tion of sporicidal activity - Membrane filtration method D : Antiseptika und Desinfektionsmittel, die im flssigen Zustand verweni ?t werden, mischbar mit Wasser - Bestimmung der sporiziden Wirkung - Membranfiltermethode 8 Norme franaise homologue par dcision du Directeur Gnrai de Iafnor le 20 juille
3、t 1988 pour prendre effet le 20 aot 1988. Remplace la norme homologue de mme indice de dcembre 1985. correspondance A ia date de publication de ce document il nexiste pas de norme internationale sur ce sujet. analyse Cette dtermination permet de porter un jugement sur la qualit des produits utiliss
4、comme antiseptiques et dsinfectants et de les comparer dans des condi- tions reproductibles. Eile est mene en laboratoire(in vitro) dans des conditions dtermines et permet dapprcier une inactivation dau moins 99,999 % des spores bactriennes de diffrentes espces. descripteu rs Thsaurus International
5、Technique : dsinfectant, produit miscible leau, essai biologique, mthode par filtration, sporicide, conditions dessai. modif cations Par rapport la prcdente dition, les modifications portent sur lamlioration du mode opratoire, linterprtation des rsultats qui ne seront plus quantifis et la suppressio
6、n de substances interfrentes. correct ions e dite et diffuse par lassociation franaise de normalisation(afnor), tour europe cedex7 92080pari.s la dfense - tl. : (1)42 91 55 55 afnor 1988 afnor 1988 1 er tirage 88-08 I AFNIi NF T72-231 88 L!3%2372 0157872 77T Antiseptiques et ds nf ecta nts utiliss l
7、tat liquide, miscibles leau Dtermination de lactivit sporicide Mthode par filtration sur membranes NF T 72-231 Aot 1988 A VANT-PROPOS La prsente norme dcrit une mthode gnrale destine : - rechercher sur des spores bactriennes si un produit liquide propos comme antiseptique ou dsinfec- tant possde ou
8、non une activit sporicide dans les conditions de laboratoire dfinies par la norme, - comparer dans des conditions reproductibles divers produits entre eux. Lattention des utilisateurs de la prsente norme est attire sur le fait que les conditions pratiques tant toujours diffrentes des conditions de l
9、aboratoire dfinies par la norme en ce qui concerne : - la nature et la quantit des spores bactriennes et le milieu o elles se trouvent, - la temprature, - le taux de destruction requis pour les microorganismes, il est indispensable pour les applications pratiques de complter cette norme par dautres
10、essais qui peuvent sappuyer par exemple sur les normes NF T 72- 7 90 et NF T 72-28 I. . 1 2 3 4 4.1 4.2 5 5.1 5.2 5.3 6 7 7.1 e 7.2 7.3 7.4 7.5 7.6 7.7 7.8 7.9 7.10 7.1 1 7.1 2 7.13 8 8.1 8.2 8.3 09 9.1 9.2 10 10.1 10.2 10.3 10.4 10.5 11 11 . 1 11.2 11.3 12 e 13 AFNL NF T72-231 88 I 1012372 0159873
11、626 -3- NF T 72-231 SOM MAI RE OBJET DOMAINE DAPPLICATION RFERENCES DFINITIONS Sporicide . Dtermination de lactivit sporicide PRINCIPE Essai prliminaire . Essai proprement dit Conduite des essais SOUCHES DE RFRENCE EAU. MILIEUX DE CULTURE ET RACTIFS DIVERS . Composants et ractifs . Bouillon pour la
12、prparation de Iinoculum de Bacillus Glose pour la prparation des spores de Bacillus Glose pour le dnombrement des spores de Bacillus Bouillon pour la prparation des inoculum de Clostridium Glose pour la prparation des spores de Clostridium Glose pour le dnombrement des spores de Clostridium Diluant
13、des suspensions de spores Liquide de rinage Neutralisant . Coloration des prparations microscopiques . Obtention de lanarobiose APPAREILLAGE ET VERRERIE . Appareillage . Verrerie Strilisation . PRPARATION DES SPORES Ea u . . . . Prparation des spores de Bacillus Prparation des spores de Clostridium
14、. ESSAI PRLIMINAIRE Prparation des suspensions de spores Dnombrement des spores sur membranes ayant t au pralable en contact avec le produit . Lecture . Interprtation ESSAI PROPREMENT DIT Prparation des suspensions de spores et dnombrement des spores dans la suspension avant Dnombrement des spores s
15、ur membranes nayant pas t6.en contact avec le produit . contact avec le produit soumis lessai Essai du produit et dnombrement des spores . Validation de lessai proprement dit . EXPRESSION DES RSULTATS . PROCS-VERBAL DESSAI ANNEXE A . ANNEXE B Page 4 4 5 5 5 5 5 5 6 6 6 6 6 6 6 7 7 8 8 8 9 9 9 9 9 10
16、 10 11 11 11 11 11 12 12 12 12 12 12 12 13 13 14 14 14 15 17 NF T 72-231 AFN1 NF T72-231 88 I 1012372 0157874 562 -4- i OBJET La prsente norme a pour objet de dcrire une mthode de dtermination de lactivit sporicide des antisepti- ques et dsinfectants, utiliss ltat liquide et miscibles leau, par lapp
17、lication modifie des mthodes de dtermination de lactivit bactricide dcrites dans la norme NF T 72-1 51, par la technique de filtration sur membra ne. 2 DOMAINE DAPPLICATION II est rappel quune activit sporicide est laptitude dun produit tuer les spores bactriennes dans des conditions dfinies (NF T 7
18、2-101). 2.1 La prsente norme est applicable dans les conditions suivantes : 2.1 .I La mthode dcrite est destine principalement dterminer si des formulations commerciales possdent ou non une activit sporicide mais elle peut, fortiori, tre applique des substances utilises en tant que matires actives.
19、Elle ne concerne que lactivit sur des spores en suspension dans un liquide. 2.1.2 Le produit essay est destin tre utilis sous forme liquide et doit tre soluble ou miscible leau aux concentrations dessai. La solution ou la suspension doivent tre stables pendant la dure de lessai (2 h au moins). 2.1.3
20、 La prsente norme ne sapplique quaux antiseptiques et dsinfectants filtrables sur membrane qui peuvent tre limins par lavage et dont leffet peut tre neutralis en suivant le mode opratoire dcrit dans lessai prliminaire. 2.1.4 Les conditionsdfinies par la prsente norme vitent dans la mesure du possibl
21、e la prsence, dans les suspensions de spores bactriennes, de substances trangres (matires organiques par exemple) pouvant interfrer dans la raction entre le produit essay et les spores. Les souches ont t choisiesen particulier pour leur aptitude produire des spores exemptes de dbris de cellules vgta
22、tives. 2.1.5 Les souches de bactries sporules retenues correspondent 81 un ventail reprsentatif des popula- tions les plus frquemment rencontres. La souche de Bacillus subtilis varit niger constitue un talon international pour les agents sporicides. Cest dailleurs une des rares souches de Bacillus s
23、ubtilis dont les colonies ne sont pas envahissantes. B. cereus reprsente une espce ubiquiste proche de lespce pathogne B. anthracis. Clostridium sporogenes est une espce anarobie extrmement rpandue. Dautres espces de bactries sporules peuvent tre utilises selon le mme principe en adaptant le protoco
24、le opratoire, mais uniquement en complment des souches de rfrences. 2.2 Par la prsente norme on ne peut dterminer lactivit sporicide dun produit une concentration de 1 O0 % (une certaine dilution est toujours ncessaire par lapport de Iinoculum). Dans le cas dantiseptiques et dsinfectants utilisables
25、 sans dilution, on peut dterminer si ces produits une concentration de 90 % (1 O % dinoculum) ont une activit sporicide conforme A la dfinition du chapitre 4. 2.3 Les mthodes de dtermination de lactivit sporicide (vis-vis des spores) pour la dsinfection des surfaces font lobjet des normes NF T 72-1
26、90 et NF T 72-281. Les mthodes de dtermination de lactivit antibactrienne (vis-vis des spores) des produits utiliss autrement qu ltat liquide feront lobjet dune normalisation ultrieure. AFNL NF T72-231 E bOL2372 0159875 4T9 -5- NF T 72-231 NF T 72-101 T 72-102 T 72-103 T 72-1 04 NF T 72-1 10 NF T 72
27、-1 51 NF T 72-1 71 NF T 72-1 90 NF T 72-230 NF T 72-281 Antiseptiques et dsinfectants - Vocabulaire. Dsinfectants - Guide dinterprtation des normes pour apprcier lefficacit des dsinfec- tants dans le secteur hospitalier et mdical. Dsinfectants - Guide dinterprtation des normes pour apprcier lefficac
28、it des dsinfec- tants dans les secteurs agricole et agro-alimentaire. Dsinfectants - Procds de dsinfection des surfaces par voie arienne - Guide dutilisa- tion en fonction des rsultats obtenus selon la mthodologie NF T 72-281 dans les secteurs hospitalier, mdical, pharmaceutique et cosmtique, agrico
29、le, industriel et agro-alimentaire. Antiseptiques et dsinfectants - Dnomination et marquage de lefficacit antimicro- bienne - Fiche technique. Antiseptiques et dsinfectants utiliss ltat liquide, miscibles leau - Dtermination de lactivit bactricide - Mthode par filtration sur membranes. Antiseptiques
30、 et dsinfectants utiliss ltat liquide, miscibles leau - Dtermination de lactivit bactricide en prsence de substances interfrentes de rfrence - Mthode par filtration sur membranes. Dsinfectants de contact utiliss ltat liquide miscibles leau - Mthode des porte- germes - Dtermination de lactivit bactri
31、cide fongicide et sporicide. Antiseptiques et dsinfectants utiliss ltat liquide, miscibles leau et neutralisables -Dtermination de lactivit sporicide - Mthode par dilution-neutralisation. Antiseptiques et dsinfectants utiliss ltat liquide, miscibles leau - Procds de dsinfection des surfaces par voie
32、 arienne - Dtermination de lactivit bactricide, fongicide et sporicide. 4 DEFINITIONS 4.1 Sporicide Produit ou procd ayant la proprit de tuer les spores bactriennes dans des conditions dfinies(si le produit ou le procd est slectif vis-vis dune espce bactrienne ceci doit tre prcis) (1). 0 4.2 Dtermin
33、ation de lactivit sporicide Dtermination de la capacit ou non dun produit rduire dau moins lo5 fois le nombre de spores vivantes appartenant des souches dtermines de 3 espces bactriennes, en 1 h 20 OC et (ou) 5 min 75 OC. 5 PRINCIPE 5.1 Essai prliminaire Filtration des suspensions de spores sur des
34、membranes ayant pralablement reu le produit concentration maximale essayer dans lessai proprement dit et rinces afin dliminer au maximum le produit. Incubation de ces membranes sur milieu glos; dnombrement des colonies obtenues et comparaison une srie tmoin ralise dans les mmes conditions mais sans
35、filtration pralable du produit essayer. (1) Selon NF T 72-101. e- - NF T 72-231 AFNL NF T72-231 I 1012372 0157876 335 W -6- 5.2 Essai proprement dit Mise en contact des suspensions de spores pendant 1 h 20 OC et (ou) 5 min 75 OC avec diffrentes concentrations du produit. Filtration sur membranes et
36、lavage des spores ainsi spares du produit essay. Dnombrement des spores viables, avant et aprs mise en contact, aprs incubation de ces membranes sur milieu glos ventuellement additionn de neutralisant. 5.3 Conduite des essais Les essais prliminaires conduisant au choix de la mthode de rinage sur mem
37、brane doivent tre mens pralablement lessai proprement dit. Comme il est ncessaire lors des essais dfinitifs de contrler lefficacit du mode de rinage retenu, les deux essais seront ensuite raliss simultanment. 6 SOUCHES DE REFERENCE Trois souches doivent tre utilises pour les essais. On peut se les p
38、rocurer auprs de la Collection Nationale de Culture de Microorganismes de lInstitut Pasteur (CNCM) ou auprs de IAmerican Type Culture Collection (ATCC). 6.1 Bacillus cereus CIP 7 803 (1 ). 6.2 Bacillus subtilis var. niger CIP 7 71 8 (1 ) (ATCC 9 372). 6.3 Clostridium sporogenes 51 CIP 7 939 (1 ). 7
39、7.1 Eau Leau utilise doit tre strile et frachement distille (et non simplement dminralise), exempte de subs- tances toxiques ou inhibitrices pour les microorganismes. Dans le cas OU le laboratoire aurait des difficults se procurer une eau distille de qualit suffisante, il peut utiliser de leau pour
40、prparation injectable (dfinie par la Pharmacope franaise). EAU, MILIEUX DE CULTURE ET REACTIFS DIVERS 7,2 Composants et ractifs Pour amliorer luniformit des rsultats, il est recommand dutiliser, pour la prparation des milieux de culture et des diluants, des composants de base dshydrats en poudre et
41、des produits chimiques de qualit analytique. 7.3 7.3.1 Composition Extrait de levure Tryptone 5,O g Glucose . 1,0 g Eau 1 O00 ml Bouillon pour la prparation de Iinoculum de Bacillus 2,5 g (1) Lensemble de ces souches CIP est distribu par la CNCM - Institut Pasteur - 25 rue du Dr Roux - 75724 Paris C
42、edex 15 - Tl. : (1) 45.68.82.50/51. AFNL NF T72-231 88 LO12372 0157877 271 -7- 7.3.2 Prparation Dissoudre dans leau. Ajuster le pH de sorte quaprs strilisation il soit de 7,2 f 0,2 20 OC, Rpartir dans des tubes essais raison de 10 ml par tube. Striliser lautoclave 121 OC I 1 OC pendant 20 min. NF T
43、72-231 7.4 7.4.1 Composition Glose pour ia prparation des spores de Bacillus Extrait de viande . 10,O g Extrait de levure 2,0 g MnS04, H20 . 0,04 g Agar-agar en poudre 20 25 g selon les proprits glifiantes du produit . 1 O00 ml Eau . 0 7.4.2 Prparation Dissoudre dans leau bullition. Ajuster le pH d
44、sorte quaprs strilisation il soit de 7,O la source de vide utilise doit donner un dbit rgulier de filtration. Pour obtenir une rpartition homogne des spores sur la membrane et pour viter une filtration trop longue, on rglera le dispositif de faon obtenir la filtration de 1 O0 ml de liquide (7.1 O) e
45、n 20 40 s. - Botes de Petri ergots adaptes lanarobiose. e O a I 3 O (1) Soit approximativement 10 O00 g. 1 g = 9,81 m.s2. AFN1 NF T72-231 88 111 1012372 0159881 7T2 - 11 - NF T 72-231 0 8.2 Verrerie Matriel classique de laboratoire (tubes, fioles coniques, flacons visser, pots de centrifugation en v
46、erre ou en matire plastique strilisables lautoclave, etc.). Pour viter les problmes lis au recyclage de la verrerie, les tubes contenant le produit, les dilutionset les suspensions microbiennes, les pipettes utilises, doivent tre en verre neutre strile, A usage unique. 8.3 Strilisation - Strilisatio
47、n sche 170OC au moins, pendant 1 h au minimum, ou 180 OC au moins, pendant 30 min au minimum, - strilisation humide 121 OC f 1 OC, pendant 20 min au minimum, - strilisation par filtration sur des membranes ayant des pores de 0,45 pm. 9 PREPARATION DES SPORES 9.1 Prparation des spores de Bacillus a Ensemencer le bouillon (7.3) avecenviron 1 O6 spores provenant dun lot prcdemment prpar. Incuber 30% de manire obtenir une culture en phase de croissance exponentielle contenant environ IO7 bacilles par millilitre. Transfrer 2 ou 3
